河南汉族动脉硬化性脑梗死人群血小板膜糖蛋白Iba基因VNTR多态性检测*

李 涛，尚迎辉，白峻瑜，石聪聪，封青川，贺 颖，郑 红

1)郑州大学基础医学院细胞生物学与医学遗传学教研室 郑州450001 2)郑州市市直机关医院内科 郑州450007#通讯作者，女，1966年3月生，博士，教授，研究方向:遗传性疾病致病基因的筛选，E-mail:hzheng@zzu.edu.cn

血小板膜糖蛋白(glycoprotein，GP)Ib-IX 复合物是血小板膜的主要糖蛋白之一，在血小板表面形成血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)的受体，参与血小板黏附于受损血管壁的反应，其亚单位GPIba 基因多态性能够改变GPIb-IX-V 的抗原性，调节其结构和表达水平，影响血小板的黏附、聚集和活化反应，参与动脉粥样硬化的发生、血栓栓塞的形成和血管痉挛等各个环节，与心脑血管疾病的发生密切相关［1］。其中GPIba 编码巨球肽区域39个碱基的可变数目串联重复序列(variable number of tandem repeats，VNTR)数目的改变可致多肽链上399 位丝氨酸残基到411 位苏氨酸残基的改变，从而影响蛋白质的功能。目前关于血小板GPIba 基因VNTR 长度多态性与动脉硬化性脑梗死(atherothrombotic brain infarction，ABI)关系的研究［2-4］结论尚不一致。作者应用PCR 法对河南汉族434例ABI患者和500例健康对照进行GPIba 基因VNTR 长度多态性检测，探讨GPIba 基因VNTR 多态性与ABI的关系，为ABI 的防治提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 遵循知情同意原则，随机选取2004年12月至2006年6月河南省二甲以上医院神经内科住院的ABI 患者434例(病例组)，均经临床检查(病史、体征、生化检验、CT 或MRI)确诊。434例中男280例，女154例，年龄28～88(62.2±12.2)岁。正常对照选自同期健康体检的随机个体500 人(对照组)，其中男305 人，女195 人，年龄21～89(62.6±12.2)岁。该研究个体间无血缘关系，均为河南汉族人群。排除患有心、脑血管疾病及肝、肾、内分泌疾病者。

1.2 GPIba 基因VNTR 多态性检测 抽取上述研究对象清晨空腹外周静脉血3 mL，EDTA 抗凝，用常规酚/氯仿法提取基因组DNA，其含量用紫外分光光度计测定。VNTR 引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物序列5’-CACTACTGAAC CAACCCCAAG-3’，下游引物序列5’-TTGTG GCAGACSCCAGGATGG-3’，扩增产物大小为195～312 bp。PCR 扩增体系:模板DNA 2 μL，STR 10×Buffer 2.5 μL，上、下游引物(5 μmol/L)各6 μL，Taq DNA 聚合酶0.3 μL，纯水补至25 μL。PCR 扩增条件:94℃预变性3 min;94℃变性30 s，63℃复性45 s，72℃延伸45 s，循环40 次;72℃延伸5 min。25 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增产物，凝胶成像仪上观察并照相。由于GPIba 基因VNTR 多态性可产生4种等位基因类型，即A:312 bp 基因片段，含有4 个重复序列;B:273 bp 基因片段，含有3 个重复序列;C:234 bp 基因片段，含有2 个重复序列;D:195 bp 基因片段，含有1 个重复序列。因此，理论上可产生AA、BB、CC、DD、AB、AC、AD、BC、BD 及CD 共10 种基因型。

1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0 处理数据。应用χ2检验比较2组间VNTR 基因型频率的差异;计算比数比(OR)及95%CI。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 GPIba 基因VNTR 多态分型 见图1。该研究中病例组未发现BB 和AB 基因型，对照组未发现AA、BB 和AB 基因型。

2.2 Hardy-Weinberg 遗传平衡检验 对照组各基因型频率的分布均符合Hardy-weinberg 平衡(χ2=2.887，P=0.089)，说明该样本具有良好的人群代表性。

2.3 2组GPIba VNTR 各基因型及等位基因频率比较 见表1、2。

2.4 河南汉族人群与其他地区人群GPIba 基因VNTR 等位基因频率的比较 见表3。

表2 ABI组和对照组GPIba的VNTR 各等位基因频率的分布例(%)

表3 河南汉族人群VNTR 等位基因频率与其他地区人群相应各等位基因分布频率比较

3 讨论

GPIb-IX 复合物是血小板膜的主要糖蛋白之一。GPIb 相对分子质量约为165 000，有2 个亚单位，即GPIba 和GPIbb。GPIba 含有凝血酶高亲和力的结合位点，可在低凝血酶浓度时激活血小板，进而影响血小板的黏附、聚集和活化反应过程，促进血栓形成［11］。

GPIba 基因位于17 号染色体短臂，具有高度多态性。第一个被确定的多态性即VNTR。随着VNTR 重复序列次数的增加可使vWF 与凝血酶在GPIba 的结合位点延伸到细胞膜外，远离血小板膜。这种结构变化的潜在影响是将靶分子暴露于更大的剪切力之下，导致剪切力诱导的vWF 和GPIba 相互作用的阈值降低。此外，与vWF 的有效结合需要至少包含2 条GPIba 多态的超复合体，杂合子含两种等位基因长度不对称可能影响GPIba 与配体结合［12］。因此，赵宇等［13］认为，如果GPIba 基因VNTR 多态性与血栓性疾病的发生相关，应该是VNTR 含重复序列较多的等位基因和杂合子基因型。

该研究发现:在河南汉族人群中，病例组GPIba基因CD 基因型频率和BC 基因型频率高于对照组，且CD 和BC 基因型个体发生ABI 的风险升高，提示CD 与BC 基因型可能是河南地区汉族人群ABI 发生的易感基因型，尤其是CD 基因型在河南汉族人群的分布更为普遍，这种易感基因型的风险更大;这符合Jilma-Stohlawetz 等［12］关于VNTR 杂合子基因型CD 拥有较低的剪切诱导阈值，导致患病风险增大的假设。该研究还显示，携带B 等位基因的个体发生ABI 的风险增加，与Mikkelsson 等［14］报道B 等位基因是青壮年心肌梗死的危险因素的研究结果一致。此外，该研究还显示病例组DD 基因型频率低于对照组，且DD 基因型个体发生ABI 的风险明显降低，提示VNTR 多态性中DD 基因型与ABI 的发生呈负相关，DD 基因型可能是河南地区ABI 发生的遗传保护因子。

另外，与中国蒙古族人群、高加索人群、非洲人群和印度人群比较，4 种等位基因频率差异较大，由此也说明了该VNTR 多态性分布的复杂性。

综上所述，VNTR 多态性中CD 和BC 杂合基因型可能是河南地区汉族人群ABI 发生的危险因子，而DD 基因型可能是遗传保护因子。

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