重铬酸钾对大鼠睾丸支持细胞中雄激素结合蛋白、转铁蛋白和抑制素蛋白表达的影响

宋中立，刘海东，王祚懿，李时恩 ，陈小玉，姚 武，吴逸明

1)郑州大学公共卫生学院劳动卫生学教研室 郑州450001 2)乳山市疾病预防控制中心 乳山264500

#通讯作者，男，1955年2月生，本科，副教授，研究方向:工业毒理，E-mail:shienli369@126.com

铬(chromium，Cr)广泛存在于自然环境及工业生产环境中，目前铬及其化合物尤其是六价铬［Cr(Ⅵ)］对生殖系统的影响逐渐受到重视［1］。睾丸是雄性生殖系统中最重要的生殖腺，同时也是大多数外源化学物生殖毒性的靶器官，其中的支持细胞(sertoli cell，SC)是睾丸曲细精管内惟一的体细胞，在雄性生殖系统中起重要作用，其分泌的雄激素结合蛋白(androgen binding protein，ABP)［2］、转铁蛋白(transferrin，Tf)和抑制素(inhibin，INH)已被广泛用作衡量SC 功能的标志［3］。该研究通过体外原代培养大鼠睾丸SC，使其暴露于不同浓度的重铬酸钾，从蛋白表达水平分析SC 中ABP、Tf 和INH 表达的变化，探讨重铬酸钾对雄性生殖系统的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂 18～21日龄的清洁级雄性SD 大鼠，体质量45～50 g，以睾丸未降出腹腔为准［购自河南省实验动物中心，许可证号:SCXK(豫)2005-0001］。重铬酸钾(天津化工厂)，优级胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，DMEM-12 培养基(美国Gibco 公司)，即用型兔抗大鼠ABP 多克隆抗体、兔抗大鼠Tf 多克隆抗体、兔抗大鼠INH 多克隆抗体、兔抗大鼠GADPH 多克隆抗体(武汉市博士德生物工程有限公司)，ECL 显色试剂盒(美国PIERCE 公司)。

1.2 原代支持细胞的分离培养及鉴定［4］将SD大鼠颈椎脱臼处死，取双侧睾丸，剪碎，分别用胰蛋白酶液和胶原酶Ⅰ液消化处理，加入DMEM/F-12培养基制成细胞悬液。用体积分数0.4%台盼兰染色计数活细胞数。以(2～4)×105mL－1细胞浓度接种至细胞培养瓶，37℃、体积分数5% CO2培养箱培养，48 h 后弃培养基，用20 mmol/L、pH 为7.4 的Tris-HCl 低渗纯化，继续培养48 h，然后将细胞制成细胞悬液，用Feulgen 染色法进行处理，光镜下观察。

1.3 实验分组 调整纯化后的细胞浓度为(2～4)×105mL－1，继续培养48 h 后，将培养基更换为含重铬酸钾溶液的DMEM/F-12 培养基，根据预实验结果设计染毒浓度，重铬酸钾的浓度分别为0 mol/L、10－7mol/L、10－6mol/L，每个浓度设8 个复孔。

1.4 ABP、Tf 及INH 蛋白表达的检测 培养24 h后提取各组细胞中总蛋白，BradFord 法进行蛋白定量，计算各个样品中的蛋白浓度，绘制标准曲线，确定蛋白上样量。然后用Western blot 检测ABP、Tf及INH 蛋白的表达，选用GAPDH 为内参对照，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、抗体免疫反应、化学发光、定影显影等步骤，最后使用GENESNAP 软件对所得的结果做半定量分析。

1.5 统计学处理 采用SPSS 12.0 处理数据，应用单因素方差分析和SNK-q 检验比较不同浓度重铬酸钾培养的细胞中ABP、Tf 及INH 蛋白表达的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 Feulgen 染色鉴定 镜下可见大鼠睾丸SC 骨架模糊，网状分布，胞质呈绿色网状，核淡紫色，核内一般可以看到分散的核仁，着色较浅，核仁两侧可见两个深紫色颗粒(图1箭头所示，此深紫色颗粒与核仁呈三角形排列，为SC 特异的卫星核小体)，这说明培养存活的细胞即为SC。

2.2 3组细胞中ABP、Tf 和INH 蛋白表达的比较见图2、表1。

表1 3组细胞中ABP、Tf 和INH 蛋白表达的量比较

3 讨论

男性生殖能力下降所致不育症越来越多，这已是无可争议的事实。有研究［5］报道Cr(Ⅵ)易进入生殖细胞内而影响男性生殖系统的正常功能。作为睾丸曲细精管内惟一的体细胞，SC 具有营养、激素转化、吞噬、屏障隔离及为生精细胞提供支架的作用，还具有非常重要的分泌功能，其分泌的生物活性物质具有调节生殖系统功能的作用［6］，其中关键的有ABP、Tf 和INH 等，这些物质可以用于评估SC 的功能［7］。徐蕊等［8］研究发现，大鼠睾丸SC ABP 分泌缺乏会致大鼠进行性不育。Tf 是SC 合成并分泌的一种转铁蛋白，很多外源化学物都可影响其在SC的表达与合成，Tf 含量的高低可以作为反映睾丸SC功能的特异性标记［9］。INH 由睾丸SC 直接产生，能反映睾丸内精子的发生情况。研究［10］发现，患有精索静脉曲张男孩的INH B 水平较同一青春发育期的正常男孩低，说明INH B 可以作为SC 损伤与精子发生的标志物。

该实验发现，随Cr(Ⅵ)浓度的升高，ABP 与Tf蛋白的表达逐渐升高，但与0 mol/L 重铬酸钾组相比，ABP 蛋白只有10－6mol/L 时差异有统计学意义;而Tf 蛋白在10－7mol/L 和10－6mol/L 2 个浓度时均有统计学意义。还发现在10－6mol/L 浓度时，INH 蛋白的表达量降低，与0 mol/L 重铬酸钾组相比差异有统计学意义，这可能是由于重铬酸钾刺激的低剂量兴奋效应所致。

综上所述，不同浓度重铬酸钾作用于SC 后，细胞中可出现ABP、Tf 蛋白表达升高、INH 蛋白表达降低的变化，可能会引起雄性生殖能力的改变，甚至导致雄性生殖功能的障碍，其具体机制还有待进一步的实验验证。

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