辛伐他汀对动脉粥样硬化大鼠内脏脂肪组织中内脂素及瘦素mRNA表达的影响

李京晔，赵玉兰，董 静

郑州大学第二附属医院心内科 郑州450014

#通讯作者，女，1956年7月生，主任医师，教授，研究方向:心力衰竭、冠心病及其相关疾病，E-mail:zyl6616@126.com

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心脑血管疾病发生的主要病理基础［1］。内脂素、瘦素均是由内脏脂肪组织分泌的细胞因子，近年来的研究［2-3］表明，两者与缺氧、易损斑块破裂、内皮功能紊乱、炎症和糖脂代谢等关系密切，与AS 的发生和发展过程密切相关。他汀类药物可以通过调脂作用来防治AS。辛伐他汀是HMG-CoA 还原酶抑制剂类药物的一种［1］。作者采用RT-PCR 法检测观察了辛伐他汀对高脂高热量饲养所致AS 大鼠内脏脂肪组织中内脂素、瘦素表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂 健康雌性SD 大鼠40 只，体质量180～200 g，由河南省实验动物中心提供。基础饲料由河南省实验动物中心提供。在基础饲料基础上添加胆固醇、炼猪油等混合烤制成高脂高热量饲料。辛伐他汀片(10 mg/片)由江苏黄河药业股份有限公司提供。Trizol 试剂、RT-PCR 试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，PCR 引物由北京三博远志生物技术有限公司设计并合成。

1.2 实验分组 将40 只大鼠按随机数字表法分为4组，分别为对照组、模型组、小剂量和大剂量辛伐他汀组，每组10 只。实验过程中对照组始终以基础饲料喂养，余3组均以高脂高热量饲料进行喂养。喂养10 周后对照组及模型组各取1 只大鼠冠脉血管做病检，验证是否发生AS。之后模型组按5 mg/(kg·d)灌胃生理盐水，小剂量和大剂量辛伐他汀组分别按2.5 和5.0 mg/(kg·d)灌胃辛伐他汀。4 周后，分别取4组大鼠尾静脉血2 mL 备用;然后称重、麻醉，处死在无菌条件下取肝脏、腓肠肌、大网膜等内脏脂肪组织，液氮保存备用;取大鼠冠脉血管做病检，观察血管形态学表现。

1.3 观测指标

1.3.1 冠脉血管形态学观察 剪取主动脉根部靠近主动脉瓣环处约0.5 cm 腹主动脉，甲醛固定，石蜡包埋，于完整的血管结构处连续切片，固定于载玻片上，HE 染色，显微镜下观察。

1.3.2 动脉硬化指数(AI)测定 酶法测定总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，按公式计算AI，AI=(TC－HDL-C)/HDL-C。

1.3.3 内脏脂肪组织中内脂素、瘦素mRNA 检测采用RT-PCR 法。取大鼠内脏脂肪组织约100 mg，加入液氮完全研碎，按Trizol 说明书操作，提取总RNA，逆转录得cDNA，进行PCR 扩增，以GAPDH 为内参照。GAPDH 上游引物序列5’-AGGGGCCATC CACAGTCTTC-3’，下游引物序列5’-CAGTGCCA GCCTCGTCTCAT-3’，扩增产物大小为595 bp。内脂素上游引物序列5’-GCTAAGAAGGCGATACAA-3’，下游引物序列5’-AGAATGAGGACTGGGTGA-3’，扩增产物大小为323 bp。瘦素上游引物序列:5’-TGGGCAATGGGTTGGTAATC-3’，下 游 5’-TGGA CAATGGCAAGGTAGCG-3’，扩增产物大小为259 bp。PCR 扩增体系:逆转录产物2 μL，dNTPs 4 μL，酶缓冲液5 μL，Tap 酶0.5 μL，上、下游引物各1 μL，超纯水36.5 μL，共50 μL。扩增条件:94℃预变性2 min;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，30 个循环;72℃总延伸6 min。取5 μL 扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，EB 染色，在紫外线投射仪下观察电泳条带，用D-140 图像记录分析系统进行分析。以目的条带与GAPDH 条带灰度值的比值表示目的基因mRNA 的相对表达量。

1.4 统计学处理 采用SPSS 10.0 处理数据，各指标组间比较采用单因素方差分析及LSD-t 检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 4组大鼠冠脉血管病理表现 见图1。对照组管腔圆形，内膜、中膜和外膜分界清楚。模型组管壁明显增厚，平滑肌增生明显，细胞排列紊乱，内膜增厚，存在脂质沉积等AS 样改变。大剂量辛伐他汀组管壁较模型组变薄，内膜和平滑肌细胞变化介于对照组和模型组之间，动脉壁细胞排列较对照组紊乱。小剂量辛伐他汀组管壁较模型组变薄，较大剂量辛伐他汀组稍厚，其内膜和平滑肌细胞变化介于模型组和大剂量辛伐他汀组之间。

图1 4组大鼠冠脉血管病理表现

2.2 4组大鼠AI 及内脏脂肪组织中内脂素、瘦素mRNA 的表达 见图2、表1。

图2 4组大鼠内脏脂肪组织中内脂素(上)、瘦素(下)mRNA 的表达

表1 4组大鼠AI 及内脏脂肪组织中内脂素、瘦素mRNA 测定结果

3 讨论

AS 主要累及大中动脉，导致相应脏器缺血和损伤，是造成心脑血管疾病和死亡的重要原因［1］。脂质代谢异常是其最重要的危险因素。他汀类药物通过AS 竞争性抑制HMG-CoA 还原酶活性，阻断肝脏内胆固醇合成，促进LDL 受体的转录，改变极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL)的组成等，可引起VLDL 合成减少和LDL 产生减少［1］。他汀类药物同时还具有改善内皮细胞功能，影响血管平滑肌细胞增殖，干扰血小板聚集、凝血、纤溶过程和拮抗炎性反应等调脂外作用［4］。临床研究［2］表明他汀类药物可以有效改善AS 患者的预后。该研究结果也显示，辛伐他汀可有效降低AS 模型大鼠的AI，同时减轻AS 模型大鼠冠脉血管的病理变化。

研究［3-4］发现，内脂素可通过旁分泌/自分泌途径作用于内脏脂肪组织，促进脂肪组织的分化、合成与积聚。Kim 等［5］研究发现，内脂素通过细胞外信号调节激酶1/2，促进内皮大量新生血管生成，导致血管平滑肌增殖，引起动脉硬化斑块扩大、破裂和血栓形成。瘦素是1994年被发现的第一个脂肪细胞因子，越来越多的实验证实高瘦素水平与AS 密切相关，是AS 独立的危险因子［6］。Yamagishi 等［7］的实验表明，瘦素可增加单核细胞趋化蛋白1 的转录，诱导线粒体超氧化物的产生，增加氧自由基，导致长期反复氧化应激，从而加速AS 的形成。Corsonello等［8］研究发现高水平瘦素通过协同二磷腺苷，促血小板聚集、增加血小板内游离Ca2+的浓度，从而促进血小板的黏附与聚集，增加血液黏度，促进血栓形成，从而促进AS 的形成和发展。

作者观察到AS 模型大鼠内脏脂肪组织中内脂素、瘦素表达水平明显升高;而辛伐他汀灌胃后大鼠内脏脂肪组织中2 者的表达水平明显降低，尤其大剂量辛伐他汀组变化更为明显。

综上所述，内脂素、瘦素可能促进了AS 的发生发展，而辛伐他汀可能通过降低2 者的表达，从而稳定斑块，延缓AS 进程，这可能是其调脂外的又一作用。

［1］徐叔云.临床药理学［M］.3 版.北京:人民卫生出版社，2006:279

［2］Keating GM，Robinson DM.Rosuvastatin:a review of its effect on atherosclerosis［J］.Am J Cardiovasc Drugs，2008，8(2):127

［3］Fukuhara A，Matsuda M，Nishizawa M，et al.Visfatin:a protein secreted by visceral fat that mimics the effects of insulin［J］.Science，2005，307(5708):426

［4］Wang Z，Nakayama T.Inflammation，a link between obesity and cardiovascular disease［J］.Mediators Inflamm，2010，2010:535918

［5］Kim SR，Bae SK，Choi KS，et al.Visfatin promotes angiogenesis by activation of extracellular signal-regulated kinase 1/2［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，357(1):150

［6］Bakhai A.Adipokines-targeting a root cause of cardiometabolic risk［J］.QJM，2008，101(10):767

［7］Yamagishi SI，Edelstein D，Du XL，et al.Leptin induces mito chondrial superoxide production and monocyte chemoattractant protein-1 expression in aortic endothelial cells by increasing fatty acid oxidation via protein kinase A［J］.J Biol Chem，2001，276(27):25096

［8］Corsonello A，Perticone F，Malara A，et al.Leptin dependent platelet aggregation in healthy，overweight and obese subjects［J］.Int J Obes Relat Metab Disord，2003，27(5):566