三种方法检测Aβ所致PAJU细胞凋亡

丁斌蓉 涂秋云 杨 霞 白 松 刘 肖 唐湘祁 (中南大学湘雅三医院老年科，湖南 长沙 4003)

研究表明Aβ神经毒性涉及介导氧化应激及炎症反应、神经元内钙超载、诱导细胞凋亡、改变突触功能等多个方面〔1～5〕。其中，诱导细胞凋亡是Aβ神经毒性的一个重要环节。脑卒中和脑缺血后阿尔茨海默病(AD)的发生率显著增加，缺氧是AD的病因之一〔6〕。故观察缺氧条件下Aβ作用所致神经细胞凋亡的情况对探讨AD的损伤机制和评估各种防治因素的效果具有重要意义，选择一种合适的检测细胞凋亡的方法对观察效果起着决定性的作用。为选择一种理想的检测神经细胞凋亡的方法，我们对MTT法、Hoechst 33258细胞核染色法、流式细胞检测这几种常用的观察细胞凋亡的方法进行了观察。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人神经母细胞瘤细胞株(PAJU细胞由芬兰赫尔辛基大学生命科学院 Carl G.Gahmberg教授惠赠);Aβ42(rPeptide公司);MTT、Hoechst 33258(Sigma公司);DMEM powders(Gibco公司);胰蛋白酶粉(Amoresco公司);低温高速冷冻离心机(Eppendorf)，酶标仪 (SUNRISE，TECAN，Switch);流式细胞计数仪(FACScan，BECTON DICKINSON，USA);荧光显微镜 (BX60，OLYMPUS，Japan);Microtek ScanMaker 5600 扫描仪。

1.2 方法

1.2.1 Aβ42的“老化”处理〔7，8〕以储存浓度为231 μmol/L 置于37℃的PBS中孵育7 d左右即为“老化”状态。

1.2.2 细胞培养 PAJU细胞以5×105/孔接种于6孔细胞培养板，37℃，培养稳定后，分组:①常态组:常态 PAJU细胞50 ml/L CO2培养箱培养96 h;②Aβ干预组:将PAJU细胞予以浓度为1.0 nmol/L老化的Aβ42干预，继续培养96 h;③缺氧组:将PAJU细胞置于缺氧环境(1% ～2%O2、5%CO2、93%N2培养箱)培养96 h;④Aβ干预+缺氧组:将PAJU细胞予以浓度为1.0 nmol/L老化的Aβ42干预，并置于缺氧环境中培养96 h。收取细胞样品，分别用MTT法、Hoechst 33258细胞核染色、流式细胞术检测细胞凋亡。

1.2.3 MTT法观察细胞 取对数生长期的上述各组PAJU细胞，于干预前1 d以5×104/孔接种于无菌的96孔板。……