HO-1 siRNA表达载体的构建及其稳定转染SGC7901细胞系的建立

张涛，白芳云，白飞虎

(1.宁夏医科大学，宁夏银川 750004;2.宁夏医科大学总医院，宁夏银川 750004)

血红素加氧酶(heme oxygenase，HO)是血红素分解代谢过程中的限速酶，人体内的CO主要是由HO代谢产生的。目前认为HO有3种形式:氧应激诱导型(HO-1)、组成型(HO-2)及尚未明确的HO-3。HO-1是血红素降解的一种限速酶，其将血红素分解产生CO、Fe2+和胆绿素。研究表明，HO-1不仅在机体生理状态下发挥作用，更主要的是在机体非正常状态或应激状态中发挥作用。大量研究证实HO-1参与体内各种氧化应激损伤及炎症反应，发挥抗炎、抗凋亡及细胞保护作用［1］。近年来大量研究发现，HO-1与肿瘤增殖、血管发生、凋亡等生物学行为密切相关［2］。本实验将通过构建抑制HO-1表达的siRNA表达载体，脂质体转染SCG7901细胞，利用G418筛选稳定转染的细胞系并进行筛选鉴定，为进一步进行HO-1在肿瘤发生过程中可能存在的相关机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

感受态大肠杆菌E．coli DH5α和SGC7901细胞为第四军医大学西京消化病医院实验室制备和保存;高保真PyrobestTMDNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ购自TaKaRa公司;RTPCR反应试剂盒及质粒提取试剂盒购自北京天根生物公司;PCR引物由Invitrogen公司合成;转染试剂Lipofectamine 2000为Invitrogen公司产品;RPMI 1640培养液为Hyclone产品;新生牛血清购自杭州四季青责任有限公司;G418购自Amresco公司;DEPC购自上海生工生物工程技术服务有限公司;总RNA提取Trizol购自Promega公司;兔抗人HO-1单克隆抗体和兔抗人β-actin单克隆抗体购自EPITOMICS公司;辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG-HRP购自TakaRa公司。

1.2 主要仪器

二氧化碳(CO2)培养箱:3110 SeriesⅡ水套，美国Thermo Scientific公司;超净工作台:单人单面VS-840-1，苏州净化设备仪器厂;倒置荧光显微镜:IXTIA22FL/PH，日本 Olympus。……