类风湿关节炎患者干扰素调节因子4基因表达变化的研究

尹春香，王晓非

（中国医科大学附属盛京医院风湿免疫科，沈阳 110004）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是以侵蚀性滑膜炎为特点的自身免性疾病，其主要临床特征是对称性关节炎和功能下降。干扰素调节因子家族是能对干扰素的基因表达进行调控的一类转录因子，通过调控淋巴细胞分化、平衡过程，参与炎性反应、细胞周期和细胞凋亡等生物学过程，在自身免疫性疾病发病中起一定作用。目前已知干扰素调节因子4（interferon regulation factor，IRF4）作为干扰素调节因子的一种，通过影响淋巴细胞的分化及干扰素转录调控等参与炎症过程［1］，在自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮［2］等发病中起重要作用。本文对RA患者外周血IRF4的表达进行研究，分析其与相关临床活动性指标的关系，初步探讨IRF4在RA发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 临床资料

30例患者来自中国医科大学附属盛京医院风湿免疫科2012年12月住院患者，其中女25例，男5例，年龄26～48岁，平均（36±12）岁，所有患者均符合1997年美国风湿病学会（ARA）制定的RA分类标准，排除有严重心脑血管、肝肾疾病和其他自身免疫病。正常对照组28名，其中女22名，男6名，年龄21～54岁，平均（35±6）岁，均为我院体检的正常人群，均身体健康，无肝、肺、肾脏疾患病史，无心血管系统病史，查体及血生化检查均无异常。研究组与对照组在性别、年龄构成上差异无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器和试剂：Trizol试剂（美国Invitrogen公司）、反转录试剂盒（日本TaKaRa公司）、SYBR green PCR试剂盒（日本TaKaRa公司）、聚合酶链反应（PCR）扩增仪ABI9700型（美国ABI公司）。

1.2.2 实验步骤

1.2.2.1 Trizol法抽提总RNA 安静状态下抽取静脉全血1 mL，柠檬酸钠（ACD）抗凝，用淋巴细胞分离液分离获得白细胞，按每毫升全血加入1 mL Trizol的比例加人Trizol试剂，使沉淀的白细胞溶解，依次加入氯仿、异丙醇、乙醇抽提，以焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解总RNA，-80℃冰箱低温保存。

1.2.2.2 使用TaKaRa公司的反转录试剂盒 总体积 20 μL，ddH2O：12 μL，mRNA：4 μL，PrimeScript RT Master Mix：4 μL，反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃5 s。

1.2.2.3 引物设计 检索NCBI数据库查到人类IRF4基因的cDNA全长序列，以甘油醛⁃3⁃磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参照基因，设计扩增板的引物，各引物均由TaKaRa公司合成，IRF4正向引物：5′⁃GCCCAGCTTGTGAAAATG ⁃3′，反向引物：5′⁃CGGC AGTCTGAGAACGC ⁃3′；GAPDH正向引物：5′⁃GAAGGTGAAGGTCGGAGTC ⁃3′； 反向引物：5′⁃GAAGATGGTGATGGGATTTC⁃3′。

1.2.2.4 荧光定量PCR反应 总体积为20 μL：SYBR混合物10 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，ROX 0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 5.6 μL。PCR循环条件：95 ℃ 15 s；95 ℃ 5 s，61 ℃ 30 s（共40个循环）。

以SDS2.1软件分析其CT值。CT值反映了模板扩增到一定量拷贝数时（处于指数上升期）所需反应循环数的大小。CT值越大，参与反应的起始模板量就越少，反之则越多。计算出标化后的-△△CT值。

1.2.3 RF、CCP、CRP、血沉的检测：由我院检验科协助完成，异常指标的判断均参考同期该项检查的正常值。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17统计分析软件包统计分析，计量资料均采用±s。各组-△△CT值采用t检验，IRF4 mRNA水平与其他血清学指标之间相关性检验采用Pearson相关分析，以P＆lt;0.05为差异有统计学意义。

2 结果

IRF4 mRNA定量表达：RA患者IRF4 mRNA的表达（-6.94±0.10）明显高于正常对照组（-7.62±0.13），差异有统计学意义（P＆lt;0.01）。

IRF4 mRNA水平与RA患者红细胞沉降率、CRP、RF、CCP进行相关性分析RA患者IRF4 mRNA水平与类风湿因子（RF）呈正相关（r=0.726，P＆lt;0.05）、与抗环瓜氨酸多肽（抗CCP）抗体呈正相关（r=0629，P＆lt;0.05），与血沉、CRP不相关（P＆gt;0.05）。

3 讨论

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以侵蚀性滑膜炎为特点的自身免疫性疾病。RA患者由于滑膜的炎症以及过度的增生致软骨和骨的进行性破坏，最终导致严重的残疾并导致患者生活质量下降。尽管RA的发病机制目前还不明确，但随着分子生物学和免疫学的进展，RA动物模型的建立，人们发现RA发病机制与Th细胞的亚型及相关细胞因子平衡密切相关，Th17/调节性T细胞及相关细胞因子平衡可能与RA发病机制相关。大量的研究认为Thl7细胞能产生IL⁃17、IL⁃21等细胞因子，功能在于通过这些细胞因子集体动员、募集及活化中性粒细胞，从而介导中性粒细胞向炎症部位迁移，诱导炎性反应。

IL⁃17是Thl7细胞产生的最重要效应因子，其受体在体内广泛表达，具有强烈的促炎症作用。Thl7细胞的生物学活性主要通过IL⁃17来实现。IL⁃17通过诱导炎性趋化因子的产生刺激炎性细胞的聚集，通过促进促炎性细胞因子（TNF⁃α，IL⁃6和 IL⁃1）的产生增强炎性反应，通过上调RANK配体的表达、诱导一氧化氮的产生和基质金属蛋白酶的表达介导软骨的破坏和骨侵蚀［3，4］，在患有RA的鼠和人群中，IL⁃17的产生增加，且其升高水平与关节破坏的严重程度相关，缺乏IL⁃17的鼠不会发生胶原诱发性关节炎（CIA）［5，6］。IL⁃21对于类风湿关节炎的病理生理有多种作用，是B细胞应答和免疫球蛋白G（IgG）产生的主要调节因子［7，8］，在RA患者异常的免疫应答中起重要作用，RF和抗CCP抗体之类的自身抗体的表达最具特征性［9］，阻断IL⁃21/IL⁃21受体途径能有效改善CIA的病变，去除IL⁃21的鼠其关节炎的进展被完全阻止。

最近的研究表明干扰素调节因子4（interferonregulatory factor 4，IRF4）可调控Thl7分化的基础性作用。无论是在经典的（TNF⁃β与IL⁃6）还是替代的（TNF⁃β与IL⁃21）Thl7细胞诱导条件下培养，IRF4缺陷小鼠的CD4+T细胞均不能完全分化成Thl7细胞并产生IL⁃17。这一缺乏对CD4+T细胞来说是内在的，而不是继发于任何发展变化中。IRF4作为Thl7分化的一个重要控制因子，在体内具有重要作用。IRF4不仅是IL⁃17的早期产生必不可少的，而且也是Thl7细胞自分泌IL⁃21绝对需要的。事实上，无论是根据经典的或替代的Thl7细胞诱导培养条件，IRF4缺乏的CD4T细胞不能产生IL⁃2l，从而对Th17细胞的形成缺少一步关键的放大作用。

本文采用荧光定量PCR方法检测RA患者外周血IRF4 mRNA表达情况，结果发现RA患者外周血IRF4 mRNA表达水平比对照组高（P＆lt;0.01），证明其与类风湿关节炎关系密切，其可能通过调节IL⁃17和IL⁃21的产生导致类风湿关节炎的发生。

近年研究证明，抗CCP抗体可用于RA的早期诊断，除了诊断性检验外，还可能是可用的预测指标，对RA患者长期随访发现，出现抗CCP抗体为发生侵蚀性关节炎的一个危险因素。抗CCP抗体阳性的RA患者更易于发展为持续性骨侵蚀性关节炎。RF阳性RA患者较RF阴性RA患者有较差的预后，在关节畸形、放射学侵蚀、关节外表现方面RF阳性RA患者中更多见、更严重。本研究显示IRF4 mRNA表达水平与类风湿因子、抗环瓜氨酸多肽抗体水平呈明显正相关，提示IRF4 mRNA表达水平可能与类风湿关节炎骨侵蚀程度相关。

综上所述，高表达的IRF4在RA的发病中起一定作用，且与疾病活动指标具有相关性，但它们之间的相互作用的关系仍不明确。应进一步加大研究IRF4与RA的相关性，以明确IRF4的作用，期待为RA的预防、诊断和治疗提供帮助。

［1］Nutt SL，Tarlinton DM.Germinal center B and follicular helper T cells：siblings，cousins or just good friends?［J］.Nat Immunol，2011，131（6）：472-477.

［2］钱捷，沈南，郭桂梅，等.系统性红斑狼疮患者干扰素调节因子IRF1 IRF4 IRF8基因表达的研究［J］.中华风湿病学杂志，2006，10（9）：513-516.

［3］Koenders MI，Joosten LA，van den Berg WB.Potential new targets in arthritis therapy interleukin（IL）⁃17 and its relation to tumour ne⁃crosis factor and IL⁃1 in experimental arthritis［J］.Ann Rheum Dis，2006，65（Suppl 3）：iii29-iii33.

［4］Lubberts E.IL⁃17/Th17 targeting：on the road to prevent chronic de⁃structive arthritis?［J］.Cytokine，2008，41（2）：84-91.

［5］Lubberts E，Koenders M1，Oppers⁃Walgreen B，et al.Treatment with a neutralizing anti⁃murine interleukin⁃17 antibody after the on⁃set of collagen⁃induced arthritis reduces joint inflammation，carti⁃lage destruction，and bone erosion［J］.Arthritis Rheum，2004，50（2）：650-659.

［6］Nakae S，Nambu A，Sudo K，et al.Suppression of immune induction of collagen⁃induced arthritis in IL⁃17⁃deficient mice［J］.J Immunol，2003，171（11）：6173-6177.

［7］Spolski R，Leonard WJ.Interleukin⁃21：basic biology and implica⁃tions for cancer and autoimmunity［J］.Annu Rev Immunol，2008，26：57-79.

［8］Konforte D，Simard N，Paige CJ.IL⁃21：an executor of B cell fate［J］.J Immunol，2009，182（4）：1781-1787.

［9］Young DA，Hegen M，Ma HL，et al.Blockade of the interleukin⁃21/interleukin⁃21 receptor pathway ameliorates disease in animal mod⁃els of rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Rheu，2007，56（4）：1152-1163.