HP L C法测定乐舒洗液中蛇床子素的含量

冯 萍 毛桂福

1.广西壮族自治区桂林市人民医院，广西桂林 541000；2.广西壮族自治区柳州市妇幼保健院，广西柳州 545000

HP L C法测定乐舒洗液中蛇床子素的含量

冯 萍1毛桂福2

1.广西壮族自治区桂林市人民医院，广西桂林 541000；2.广西壮族自治区柳州市妇幼保健院，广西柳州 545000

目的 建立高效液相色谱法测定乐舒洗液中蛇床子素的含量。方法 采用Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）色谱柱，流动相：乙腈-水（80︰20）；流速：1.0 mL/min；检测波长：322 nm；柱温：30℃。结果 蛇床子素在0.28～36.8 μg/mL范围内线性关系良好（r=0.9999）。蛇床子素的加样回收率为98.2%，RSD值为4.0%（n=9）。结论 本方法操作简单，结果准确，可用于乐舒洗液中蛇床子素的测定。

乐舒洗液；高效液相色谱法；蛇床子素；含量测定

乐舒洗液是广西柳州市妇幼保健院的传统制剂，其主要成分有蛇床子、黄柏、苦参、百部、鹤虱、白鲜皮、花椒等，具有抗菌、消炎、止痒、收敛、杀灭阴道滴虫等作用。方中蛇床子为君药，所含主要有效成分为蛇床子素[1-2]，具有抗菌、止痒、抗变态反应、增强免疫力等作用。原标准中无主要成分含量的测定项，为加强对该制剂的质量控制，保证制剂疗效，笔者在参考有关文献的基础上，采用高效液相色谱法同时测定了制剂有效成分蛇床子素的含量[3-7]。现报道如下：

1 仪器与试药

岛津LC-20AT四元梯度高效液相色谱系统（LC-20AT泵，Rheodyne 7725i型进样阀，SPD-20A紫外检测器，CTO-20A柱温箱，DGu-20A在线脱气机，日本岛津），KQ-300DB型数控超声波清洗器（昆山市超生仪器有限公司），HANGPINGFA1004型电子天平（上海天平仪器厂）。

蛇床子素对照品（批号：110822-200305，中国药品生物制品检定所）。甲醇、乙腈为高效液相色谱纯试剂，水为重蒸馏水，其他使用试剂均为分析纯，乐舒洗液样品（柳州市妇幼保健院制剂室自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；柱温：30℃；流动相：乙腈-水（80︰20）；流速：1.0 mL/min；检测波长：320 nm；进样量：20 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取蛇床子素对照品18.4 mg，加甲醇溶解并定容至10 mL，即得蛇床子素对照品储备液，置-20℃冰箱保存。临用前，精密取蛇床子素对照品储备液2.0 mL，加甲醇稀释并定容至 10 mL，即得 368.0 μg/mL的蛇床子素对照品工作液；精密取该蛇床子素稀释液1.0 mL，加甲醇稀释并定容至10 mL，即得36.8 μg/mL的蛇床子素对照品工作液。

2.2.2 供试品溶液 乐舒洗液超声30 min后，精密量取4 mL置10 mL具塞玻璃试管中，加0.5 mL浓氨溶液，用4 mL乙酸乙酯振摇提取1 min，2000 r/min离心1 min，分取有机相至另一个10 mL离心管中并置95℃水浴氮气吹干，共提取3次（每次4 mL）。精密加2 mL甲醇至离心管中，涡旋溶解残渣，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液 按处方比例取缺蛇床子的药材，按照乐舒洗液制备工艺制备缺蛇床子阴性样品，再按供试品溶液制备方法操作即得缺蛇床子阴性样品溶液。

2.3 系统适应性

分别取阴性样品、混合对照品及供试品溶液进样测定，记录色谱图（见图1），结果表明，供试品色谱中蛇床子素保留时间为6.6 min，与对照品溶液的保留时间一致；阴性样品在该色谱条件下对供试品测定无干扰，分离度良好。理论塔板数以蛇床子素峰计算应不低于3000。

2.4 线性关系考察

精密吸取蛇床子素对照品工作液适量至容量瓶中，加甲醇定容至5.0 mL，制成含蛇床子素分别为36.80、22.10、8.80、3.50、1.40、0.57、0.28 μg/mL 的系列对照品溶液。分别进样20 μL，记录峰面积。以对照品浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得蛇床子素的回归方程：Y=88 037 X+7177，r=0.9999。结果提示，蛇床子素浓度在0.28～36.80 μg/mL范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验

精密吸取1.4 μg/mL蛇床子素对照液，连续进样6次，RSD值为0.56%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一批号样品6份，按“2.2.2”项下方法制备6份供试品溶液，进样测定含量。结果提示，蛇床子素的RSD值为2.86%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，于0、3、6、12 h分别进样测定4次，记录峰面积。蛇床子素的RSD值为2.46%（n=12），表明样品室温放置12 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验

精密移取4 mL已知含量的样品9份，分别置于10 mL离心管中，分别加入一定量的蛇床子素对照液，按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，测定蛇床子素的含量并计算回收率，结果提示，蛇床子素的平均回收率为98.15%，RSD为3.96%，见表1。

表1 蛇床子素的加样回收率试验

2.9 样品含量测定

分别取5批样品（20110422、20110818、20120204、20120516、20120810），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定，5批样品中蛇床子素的含量分别为 0.330、0.440、0.503、0.580 和 0.390 μg/mL。

3 讨论

本试验曾考察了几种不同的流动相系统，最后确定用乙腈-水（80︰20）作为流动相，蛇床子素与其他成分能达到基线分离，不含缓冲盐，有利于色谱系统的维护。

本研究曾在相同条件下比较了乙酸乙酯、乙醚等溶剂的提取效率，结果表明乙醚和乙酸乙酯对蛇床子素提取率相当。在提取过程中用离心法分离有机相，能大量缩短提取液分层的时间，利于提高萃取工作效率。本制剂中含有明矾，沉淀较多，超声后直接制成供试液进行测定，蛇床子素的回收率较低；滤除沉淀后制成供试液，蛇床子素的回收率有大幅度的提高，表明沉淀对蛇床子素有较大的吸附作用。

按标准规定，蛇床子药材中蛇床子素含量不得少于1.0%[8]。处方中乐舒洗液每1毫升相当于饮片量为15 mg，以上述含量指标折算，乐舒洗液中蛇床子素含量理论上应大于150 μg/mL。内控标准按80%转移率计算，乐舒洗液中蛇床子素含量应不少于120 μg/mL。从上述5批乐舒洗液样品测定结果来看，蛇床子素含量大大低于内控标准含量。如下几个因素可能是蛇床子素含量偏低的原因：制备工艺不科学，蛇床子素的脂溶性极大，制备工艺中只是用水煮沸提取2次，可能造成提取率偏低；处方设计不科学，处方中乙醇含量（0.4%）低，热水提取的蛇床子素，冷却后可能大部分都沉淀了；制剂中含有明矾，其形成的胶体可能会吸附大部分的的蛇床子素，或者其中的金属离子可能会与生物碱反应形成不溶性沉淀。曾经对未过滤的制剂进行含量测定，蛇床子素的含量在1.0～16.9 μg/mL。曾经取未过滤的制剂进行了回收率试验，加样回收率只有87%左右，但取续滤液进行加样回收率试验是符合要求的（98%以上）。由此可见，乐舒洗液的制备工艺和处方需要进一步的改进。

[1]陈艳，张国刚，余仲平.蛇床子的化学成分及药理作用的研究进展[J].沈阳药科大学学报，2006，23（4）：256-260.

[2]周则卫，沈秀.蛇床子素药理活性的研究概况[J].中国新药杂志，2006，15（20）：28-32.

[3]黄彩虹，雷鹏，刘韶，等.高效液相色谱法同时测定蛇床子中蛇床子素和异茴芹素的含量[J].中南药学，2009，7（3）：172-174.

[4]陈家仁，李应芬，何继祥.妇阴康洗液质量标准研究[J].中国医院药学杂志，2008，28（9）：698-700.

[5]郭爱枝，刘义钊，何益峰，等.妇炎净洗液质量标准研究[J].中南药学，2009，7（1）：28-31.

[6]李鹏，陈琴华，朱军，等.高效液相色谱法测定利夫康洗液中蛇床子素的含量[J].医药导报，2011，30（6）：785-786.

[7]邹渭洪，付成效，龙宇，等.RP-HPLC法测定三皮止癣酊中蛇床子素的含量[J].中国药房，2012，23（47）：4484-4485.

[8]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：11，295-296.

Determination of osthol in Leshu lotion by HPLC

FENG Ping1MAO Guifu2
1.The People's Hospital of Guilin City in Guangxi Zhuang Autonomous Region,Guilin 541000,China;2.Women and Children's Health Care Hospital of Liuzhou City in Guangxi Zhuang Autonomous Region,Liuzhou 545000,China

ObjectiveTo establish a HPLC method for the determination of osthol in Leshu Lotion.MethodsThe sample was separated on Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5.0 μm)column,with a mixture of acetonitrile-water（80︰20）at a flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was 320 nm and the column temperature was set at 30℃.ResultsThe linear range of the calibration for osthol was 0.28-36.8 μg/mL(r=0.9999).The average recoveries was 98.2%(RSD=4.0%,n=9).ConclusionThe method is sample,accuracy,and suitable for determination of osthol in Leshu Lotion.

Leshu lotion;High performance liquid chromatography;Osthol;Content determination

R927.2

A

1674-4721（2013）04（b）-0066-02

广西壮族自治区柳州市应用技术研究与开发计划课题（编号：2011J0302035）。

冯萍，性别：女；职称：主管药师；研究方向：医院药学。

毛桂福，性别：男；职称：副主任药师；研究方向：主要从事药物分析与临床药学研究工作。

2013-02-04 本文编辑：袁 成）