应用飞行时间质谱测定食品中多种真菌毒素的研究进展

张晓波，黄丽英，陈万勤，陈小珍，曹 慧，莫卫民

(1.浙江工业大学化学工程与材料学院，浙江杭州 310014;2.浙江省质量检测科学研究院，浙江杭州 310013)

真菌毒素 (mycotoxin)也称霉菌毒素，是由产毒真菌在适宜的环境条件下产生的有毒代谢产物［1］。目前已发现的真菌毒素大约有300～400种［2］，广泛存在于粮油等食品中。随着食品安全问题越来越受到重视，真菌毒素的研究亦逐渐被人们所关注。这些产毒真菌可污染原料、饲料，进而污染食品，进入人类生物链;同时在食品生产、加工和运输过程中都可能受到危害［3］。真菌毒素不仅能导致食品腐败变质、营养损失及品质降低，还具有致癌、致畸、致突变和免疫抑制毒性［4］，对健康造成极大威胁。

目前比较常用的真菌毒素检测技术有薄层色谱法 (TLC)、酶联免疫 (ELISA)、液相色谱法(LC)、气相色谱法 (GC)、液相质谱法 (LC/MS)等。虽然各有其优越性，但因同一食品可能受多种真菌毒素污染，一种真菌又可能产生多种毒素［5］，而食品基质复杂、干扰组分多，使单极质谱易出现假阳性，故不能很好解决多种真菌毒素同时检测的问题。目前常采用液相色谱-三重四极杆串联质谱(LC-QQQ/MS)分析真菌毒素，其采用多反应监测 (MRM)模式进行检测，但仍受分辨率、结构模式和扫描速率等限制，适合少量化合物的准确分析，不能满足复杂基质高通量快速筛查及精确定性分析的需求［6］。

飞行时间质谱 (TOF-MS)是利用动能相同而质荷比不同的离子飞越既无磁场又无电场的离子漂移管，经仪器记录精确飞行时间，根据时间推算出速度，并利用动能与质量的关系推导出离子质量，从而对物质成分或结构进行分析的方法［7-8］。TOFMS较其他质谱而言有2方面优势。 (1)高分辨率。TOF-MS的分辨率在20 000 FWHM以上，可精确到小数点后4位，质量准确度在一定线性范围内可小于2×10-6，从而有利于分析母离子和碎片离子的元素组成［9-10］。 (2)全扫描，高通量［11］。TOF-MS利用质荷比与时间的关系进行质量分析，绝大多数离子源产生的离子均可到达检测器，都能快速显示在一张图谱上，质量范围宽。在这个过程中既省去了离子筛选过程，又不需要采用任何电流或电压扫描，因此大大提高了离子传输效率，适合全扫描下高通量检测。

TOF-MS的这些优势在农药残留及兽药残留等食品安全分析中得到应用。随着对真菌毒素分离鉴定研究的深入，飞行时间质谱也逐步应用到真菌毒素的研究。为此，本文综述了TOF-MS的不同离子源在真菌毒素方面的应用，并对TOF-MS、四级杆-飞行时间串联质谱 (Q-TOF)和离子阱-飞行时间(IT-TOF)质谱技术在真菌毒素方面的应用进行了总结。

1 比较不同的TOF-MS离子源检测真菌毒素

不同的离子源适用于不同类型的样品，目前适用于TOF-MS的离子源有电喷雾离子源 (ESI)、大气压化学电离源 (APCI)和大气压光致电离源(APPI)。

1.1 ESI离子源

ESI离子源是目前色谱-飞行时间质谱中最常用的一种离子源，ESI属软电离技术，适用于强极性、热不稳定化合物。在TOF-MS同时检测多种真菌毒素方面，ESI源最为常用，是真菌毒素检测的首选离子源。

郑翠梅等［12］报道了LC-ESI-TOF/MS同时检测小麦和玉米中镰刀菌、曲霉菌和青霉菌产生的13种真菌毒素，对比了在ESI+模式下和ESI-模式下13种真菌毒素响应情况，发现脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (DON)、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (3-ADON)和玉米赤霉烯酮在ESI-模式下有更高的灵敏度。由于正负离子模式频繁转换带来的不稳定性，而在正模式下也可满足试验要求，故采用正离子模式检测。试验考查了ESI源不同裂解电压对离子丰度造成的影响，列举了HT-2毒素随着裂解电压的增大，各种离子丰度的变化情况， ［M+NH4］+逐渐降低，而 ［M+Na］+逐渐升高。Sirhan等［13］使用Q-TOF-MS/MS在ESI源模式下对花生、玉米等44种食物样品中的黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2进行同时检测。在试验过程中考察了不同流动相、有机相比例、流速、毛细管电压、雾化器压力和碎裂电压等因素对离子化的影响，优化了4种毒素同时检测的条件。Senyuva等［14］利用无花果干培养真菌以获得代谢物真菌毒素。在运用LC/TOF-MS分析各种毒素时发现，所有化合物都在ESI源的作用下有响应，如伏马毒素、黄曲霉毒素、土震素等大都以 ［M+H］+的形式存在。试验还发现，在所有影响ESI的参数中，碰撞诱导解离电压对结果影响最大。在不改变其他参数的情况下，碰撞诱导解离电压可在55～250 V范围内优化，最小解离电压在150 V，一般选择55～220 V进行试验效果较为理想。试验还发现赭曲霉毒A素对裂解电压十分敏感。

1.2 APCI离子源

APCI离子源通过电晕针放电使空气中的中性分子发生电离产生带电离子，这些离子与样品分子进行离子-分子反应，使样品分子离子化，适合于中等或小极性相对稳定的小分子 (分子量小于1 000～2 000 u)化合物［15］。APCI源与 ESI源相比，最大的优势是中性或弱极性化合物有更好的灵敏度，极性和非极性溶剂都可使用，比ESI源能忍耐更高浓度的盐和添加物［15］。到目前为止，关于多种毒素同时检测的文献报道中，ESI源最为常用，但其应用于镰刀毒素的效果不理想，特别是DON 及其共轭体。Zachariasova［16］利用 TOF-MS研究啤酒中的多种真菌毒素，在优化色谱条件下，对比了APCI和ESI两种离子源对32种真菌毒素离子化作用的影响。除赭曲霉毒素A和3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇外，其他镰刀菌毒素在APCI离子源下的信号响应值比ESI源强12倍，脱氧雪腐镰刀菌烯醇增强10倍。镰刀菌毒素的灵敏度提高的原因可能是APCI离子源模式能够消除钠盐和钾盐的分子离子峰的影响。Tanaka等［17］对比了ESI和APCI离子源模式下13种真菌毒素的响应，同样发现镰刀菌毒素在APCI下能获得最佳响应，故最终选择APCI检测真菌毒素。

1.3 APPI离子源

APPI离子源基于高频气流放电灯产生真空-紫外10～10.6 eV的光子，使大多数有机物 (大部分有机物第1电离点位IP=7～10 eV，水的IP=12.6 eV，甲醇的IP=10.8 eV，乙腈的IP=12.2 eV)离子化，离子化的 ［M］+.从水蒸汽或者质子溶剂中得到H.后形成 ［M+H］+，其擅长于低极性到中等极性化合物的高灵敏度电离分析［18］。Tanaka等［19］利用LC-APPI-TOF-MS分析了日本201批饼干样品的雪腐镰刀菌烯醇 (NIV)，DON，FX，3-ADON，HT-2，T-2，玉米赤霉烯酮等7种真菌毒素，对比了ESI源、APCI源和APPI源在检测这些毒素方面的特点。ESI源对于3-ADON检测灵敏度很高，定量下限达到1 pg，但基质效应也很强。APPI源研究NIV，DON，ZEN毒素时，能提供较优的灵敏度，其检出下限分别为1.8，2.5和1.3 pg。研究表明，与 ESI，APCI相比，APPI拥有较理想的线性范围和灵敏度，基质干扰弱和离子抑制作用小，对非极性化合物有着很高的灵敏度等特点。Takino［18］对比了 APCI与 APPI离子源在检测苹果汁中棒曲毒素的应用，APPI在负源的模式下获得 ［M-H］-m/z153的准分子离子，而APCI获得最强的 ［M］-m/z154信号和 ［M-H］-m/z153信号，两者线性范围与检测限相近，有区别的是APPI的图谱杂质干扰更少。于1 d后检测同样的样品，APPI的信号强度是原来的90%，而APCI只有原来的50%。目前APPI离子源在真菌毒素方面的报道还较少。

2 质谱技术在真菌毒素方面的应用

2.1 TOF 在快速筛选真菌毒素及代谢未知物方面的应用

由于TOF-MS质谱具有高分辨率，可获得化合物的精确质量数，为相似的未知化合物或离子筛查提供了较高的可信度和准确度。

Tanaka等［17］用LC/TOF-MS测定粮食及其制品中的单端孢霉烯族毒素、黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮等3类13种真菌毒素。在质量窗口宽度0.03 TH，100 ng·mL-1混标浓度下，2个质量数相差0.02 TH的雪腐镰刀菌烯醇准分子离子 ［M+NH4-H2O］+和 ［M］+在 TOF-MS高分辨质谱中能得到很好的分辨，这在低分辨质谱是做不到的。Bartok等［20］利用反相高效液相色谱-飞行时间质谱和离子阱质谱研究伏马毒素B1及其28种同分异构体，在保留4.826～32.808 min内获得伏马毒素B1及其同分异构体，获得的26个同分异构体分子的精确质量数与伏马毒素B1的精确质量数之差在0.1×10-6～1.7×10-6，其中有2个同分异构体与伏马毒素 B1相差在4.3×10-6和 -2.8×10-6。Bartok等［21］利用 ESI-IT-MS和 ESI-TOF-MS 研究了被镰刀菌污染的谷物培养基，发现了3对同分异构体，经裂解和精确质量数的分析，3对同分异构体为伏马毒素B1与脂肪酸，棕榈酸和亚油酸酯化反应的产物，其毒性、极性与伏马毒素显著不同，对毒素毒理学研究有重要意义。Vekiru等［22］采用LC/TOF-MS技术研究了经酵母毛孢子菌转化的玉米赤霉烯酮主要代谢产物，研究采用液相色谱对样品进行梯度洗脱使基质和目标物分离，在ESI-源模式下采用TOF-MS的全扫描检测，在总离子流图中提取相关的色谱峰，测得未知代谢物的保留时间和准分子离子 (m/z351.1445)，再根据碎片离子峰的精确质量数和运用元素组成分析软件，参考核磁谱图，结合化合物的裂解规律，得到未知代谢物的元素组成为C18H24O7，代谢物分子量误差为1.1×10-6。

2.2 Q-TOF及IT-TOF串联质谱技术在真菌毒素方面的应用

随着研究的细化和深入，加之食品样品基质的复杂性和真菌代谢产物的多样性，造成了谱图的复杂化，使用单级质谱难以满足试验要求，而QTOF、IT-TOF等串联质谱不仅可由谱图中的母离子进行鉴别，而且可通过一定的方式对碎片离子进行细化鉴别［10］。

2.2.1 Q-TOF质谱串联在真菌毒素方面的应用

Q-TOF质谱是将四极杆质谱与飞行时间质谱进行串联，将四级杆的高灵敏度与飞行时间的高分辨率进行高质量精度结合，在选择性离子检测模式下，四级杆将单一选择性目标离子送入两质谱间的碰撞活化室，通过碰撞诱导解离，经加速后进入TOF离子漂移管，实现质量分离［23］。Sirhan等［24］在LC-ESI-QTOF-MS/MS技术的基础上开发了一种对谷物中8类A型和B型单端孢霉烯族进行研究的新方法，在多反应监测 (MRM)模式下采用低能量碰撞诱导串联质谱 (CID-MS/MS)进行定量测定。过程中不使用固相萃取柱进行净化。采用直接进样，既节约了时间，又减少了分析成本。采用正负两种离子模式分别对A型和B型单端孢离子进行研究，获得了更低的检测限和更高的灵敏度和选择性。

结合TOF-MS精确质量分析优势，通过建立质谱库即可实现同时对多种真菌毒素的快速筛查，而无需标准物质，QTOF-MS使未知化合物结构推断变得便捷。Diaz［25］利用QTOF-MS建立了目标离子和非目标离子的2种筛选方法，对大规模不同类型样品的有机污染物进行分离分析。根据自动提取精确质量数进行目标筛选，根据自制的谱库和试验对比进行非目标排查。该方法应用在快速筛选食品中的霉菌毒素和伏马菌素方面，取得较满意的效果。普通的质谱分析时，由于离子的去质子化和一些加合离子的存在，可能影响分析的精确度及可信度，而Q-TOF采用二级碎片离子和精确质量数结合，既分析准分子离子，又寻找谱库中的碎片离子的精确质量数，大大提高了分析的可信度［26］。

2.2.2 IT-TOF串联质谱在真菌毒素方面的应用

IT-TOF是将离子阱质谱与飞行时间质谱进行串联，把离子阱全扫描模式下的高灵敏度及多级碎裂功能与飞行时间质谱高分辨率和精确分子量测定相结合，极大地提高了分析复杂基质中的痕量化合物结构的能力。通过三维空间的稳定电势区，离子阱把离子拘禁在阱内，通过选择性地积累离子，从而提高目标离子浓度，以达到提高灵敏度的目的，同时又能进一步裂解实现多级高分辨检测［27］。如果能够将此技术很好运用在真菌毒素的裂解规律上，可大大提高分析真菌毒素的能力。liu等［28］用LC-ESI-IT-TOF-MS研究了镰刀菌产生T-2、HT-2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (DON)、3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (3-AcDON)和雪腐镰刀菌醇 (NIV)5种真菌毒素，基于2，3级质谱图和精确质量数，提出了5种真菌毒素的裂解规律，研究发现A类镰刀菌如T-2和HT-2毒素采用 ［M+Na］+裂解模式，共同脱去异戊酰基和乙酸基，而B类镰刀菌DON，3-AcDON和NIV采用 ［M-H］-模式，三者的环氧裂解模式都相同。裂解碎片的研究利于5种镰刀菌毒素的分析鉴定。

3 TOF质谱技术在真菌毒素应用及展望

综上所述，TOF-MS在食品真菌毒素方面有广阔的应用前景。TOF-MS具有高分辨、全扫描、高通量等优势，适合于复杂的食品基质，可实现多种相似结构与相近分子量的毒素分析。由母离子和碎片离子的精确分子量信息，结合创库软件，可创建真菌毒素谱库，便于对复杂体系高通量快速筛选。通过与四级杆质谱相连，提高了分析的灵敏度和检出限;通过与离子阱质谱相连，达到了多级碎裂精确分析，从而提高了真菌毒素结构分析能力。可预见TOF-MS在食品真菌毒素研究领域将成为研究应用的热点。

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