头蛋白质分离及抗肿瘤作用的研究

刘 巍，丁学知*，夏立秋，孙运军，禹智辉，肖秀情，罗超枝，黄少亚

(湖南师范大学生命科学学院，微生物分子生物学湖南省重点实验室，湖南 长沙 410081)

刘 巍，丁学知*，夏立秋，孙运军，禹智辉，肖秀情，罗超枝，黄少亚

(湖南师范大学生命科学学院，微生物分子生物学湖南省重点实验室，湖南 长沙 410081)

利用Tris-HCl(pH7.5，100mmol/L)提取藠头总蛋白质，用不同饱和度硫酸铵盐析沉淀，检测饱和硫酸铵盐析后藠头蛋白质对小鼠B16黑色素瘤细胞和Meth-A细胞的抑制作用。结果表明：20%～80%饱和硫酸铵盐析制备的藠头蛋白质对白色念球菌、小鼠黑色素瘤细胞的生长均有明显的细胞毒效应，其中80%饱和硫酸铵盐析制备藠头总蛋白质抗菌抗肿瘤活性最为明显。藠头蛋白质经液相色谱-质谱(LC-MS)检测，其主要成分为凝集素、热休克蛋白、蒜氨酸酶、半胱氨酸合酶和肿瘤坏死因子受体蛋白等物质。

藠头；蛋白质；黑色素瘤；抗肿瘤作用；液相色谱-质谱

藠头又称薤白(Allium chinense)，为百合科葱属植物，现代药理研究表明其具有抗菌消炎、解痉平喘、抗血小板聚集等作用，常被作为一种有效的抗癌辅助性药物，用于临床治疗肺癌、胃癌、乳腺癌等，但其有效成分尚不清楚[1-3]。目前已有研究表明藠头多糖能消除羟自由基和抗DNA损伤[4-6]，藠头中的硫化物具有广谱抗菌作用[7]。藠头多糖和含硫化合物的抗菌抗肿瘤活性已有一些报道[8-9]，但对其蛋白质组分的抗肿瘤活性研究尚未见报道。本实验用不同饱和度硫酸铵溶液盐析制备藠头蛋白质，研究其对小鼠B16黑色素瘤细胞和Meth-A细胞的抑制作用，并对其成分进行分离鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

藠头 长沙市农贸市场特定农户购买。

1mol/L Tris-HCl(pH8) 帕弗瑞生物技术(北京)有限公司；DMEM培养基 美国Gibco公司；MTT试剂盒、二甲基亚砜(DMSO) 美国Sigma公司。

1.2 细胞株

细胞株：B16小鼠黑色素瘤细胞，Meth-A细胞本实验室保藏。

1.3 仪器与设备

HERA cell 24oiCO2培养箱 美国Forma公司；Leica DMI 倒置显微镜 德国Zeiss公司；Centrifuge 5415 R冷冻离心机 德国Eppendorf公司；AKTA高效液相色谱、YMC pack protein-RP(250mmh4.6mm)反相柱 美国GE公司；FI NNIGAN SURVEYOR四元泵高效液相色谱仪、自动进样器、LTQ XL一维线性离子阱质谱仪、BioBasic-18反相柱(0.1mmh150mm，5μm)、ZORBAX 300SB-C18预柱(0. 3mmh5mm，5μm ) 美国热电公司。

1.4 方法

1.4.1 藠头总蛋白质的制备

将保存于4℃的藠头取出，加入液氮后以1:1(m/V)的比例加入Tris-HCl(pH7.5，100mmol/L)抽提缓冲液后用组织匀浆机匀浆，4℃抽提过夜。样品用4层纱布过滤，滤液经9000r/min离心20min，去沉淀，收集上清加20%、40%、60%、80%饱和硫酸铵分别沉淀蛋白质过夜。10000r/min离心20min，收集沉淀，用少量0.01mol/L PBS溶解沉淀，10000r/min离心20min，收集上清液脱盐，Brandford法测定蛋白质浓度，—20℃保存待用。

1.4.2 MTT法检测藠头蛋白质对小鼠B16黑色素瘤细胞和Meth-A细胞的抑制作用

将小鼠B16黑色素瘤细胞和Meth-A细胞密度分别调整至5.0h104个/mL，接种于96孔板，每孔100µL。加入经不同饱和度硫酸铵(20%、40%、60%、80%)盐析制备的终质量浓度分别为20、10、5µg/mL的藠头蛋白质，每组设3个平行孔，同时设PBS的阴性对照组和20µg/mL 5-氟尿嘧啶(5-FU)阳性对照组。继续培养。药物作用24h和48h后MTT试剂盒检测，酶标仪于波长450nm处测定各孔吸光度(A450nm)，计算IC50值。同时，利用倒置显微镜10h10放大倍数下观察藠头蛋白质对B16细胞和Meth-A细胞的抑制作用。

1.4.3 藠头蛋白质的SDS-PAGE电泳分析和质谱鉴定

对具有抗肿瘤活性的藠头蛋白质进行SDS-PAGE电泳检测，切除蛋白质条带用胰蛋白酶胶内酶解，LC-MS分析鉴定主要成分。

色谱条件：反相色谱柱BioBasic-18 (0.1mmh 150mm，5μm)，流动相A2为H2O+0.1%甲酸，B2为乙腈+ 0.1%甲酸，B22%～90%线性洗脱，洗脱时间100min，流速200nL/min。

质谱条件：电喷雾电压5kV，温度275℃，毛细管电压4.5kV。

蛋白质质谱数据库搜寻鉴定：从美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库中以FASTA格式下载来源于葱属植物蛋白质作为系统内部的数据库来源，一共有128条记录。采用Sequest搜索引擎(Proteome Discoverer 1.1软件包的一部分)进行蛋白质质数据库搜寻。数据库搜寻采用下列参数：固定修饰(Cys)，可变修饰选择氧化(Met)，允许的最大未酶切位点(miss cleavages)数为2，母离子的质量容差(mass tolerances)为1.5，碎片离子的质量容差为1.0，只考虑b离子和y离子进行二级质谱鉴定。同时进行反库搜索(Target-Decoy Database),输入适当的Xcorr vs.charge值，确保假阳性率(FDR)≤0.01。

2 结果与分析

2.1 藠头粗蛋白质的制备

经Tris-HCl溶液提取，饱和硫酸铵盐析和透析后，Bradford法检测，从1000g鲜藠头中得到干质量52mg粗蛋白质，提取率为0.052%。SDS-PAGE电泳检测结果显示所得粗蛋白质为混合物，其成分和盐析所用硫酸铵饱和度有关。

2.2 藠头蛋白质对B16黑色素瘤细胞的抑制作用

图 1 80%硫酸铵制备藠头蛋白质对B16细胞(a)和Meth-A细胞的抑制率(b)Fig.1 Inhibition rates of Allium chinense protein precipitated by 80% ammonium sulfate against B16 and Meth-A cells

图 2 80%饱和硫酸铵盐析所得藠头蛋白质对B16细胞和Meth-A细胞的抑制作用(×100)Fig.2 Microscopic observation of inhibitory effect of Allium chinense protein precipitated by 80% ammonium sulfate against B16 and Meth-A cells (× 100)

实验结果表明，20%～80%硫酸铵盐析得到的藠头蛋白质对小鼠B16黑色素瘤细胞均有明显的抑制作用，其中80%硫酸铵盐析得到的蛋白质样品对肿瘤细胞抑制作用最明显，由图1a、b可知，藠头蛋白质对B16和Meth-A细胞的IC50值在24h时分别为7.834µg/mL和9.55µg/mL，48h时为11.3µg/mL和13.0µg/mL。通过对肿瘤细胞的形态学分析，发现经藠头蛋白质作用后，肿瘤细胞在凋亡过程中出现凝集现象，且凝集度随蛋白质质量浓度的升高而增加(图2)。

2.3 藠头蛋白质的质谱鉴定

藠头提取液经不同饱和度硫酸铵盐析所得蛋白质，进行SDS-PAGE电泳(图3)，切取主要胶带胰蛋白酶胶内酶解，1D-LC-MS鉴定(表1)，其主要成分为蒜氨酸酶、热休克蛋白、凝集素、半胱氨酸合酶、肿瘤坏死因子受体家族蛋白等。

图 3 SDS-PAGE电泳检测藠头蛋白Fig.3 SDS-PAGE of Allium chinense protein precipitated by 80% ammonium sulfate

表 1藠头蛋白质的LC-MS鉴定Table 1 LC-MS analysis of Allium chinense protein precipitated by 80% ammonium sulfate

3 讨 论

3.1 藠头蛋白质抗肿瘤活性研究

不同饱和度硫酸铵盐析得到的藠头总蛋白质的主要成分不同。1D-LC-MS分析藠头蛋白质成分，将实验结果和NCBI蛋白数据库比对发现藠头蛋白的主要成分为凝集素、热休克蛋白、蒜氨酸酶、半胱氨酸合酶和肿瘤坏死因子受体蛋白等物质。不同饱和度硫酸铵盐析蛋白质对肿瘤细胞作用结果显示，随着盐析硫酸铵饱和度的升高得到的蛋白质抗肿瘤活性越强，其中抗肿瘤活性最强的80%饱和度硫酸铵盐析的蛋白质主要成分是20kD以下的小分子物质凝集素，这和已有关于凝集素具有抗肿瘤活性的报道相印证。

3.2 藠头蛋白的可能作用机理

藠头蛋白质经1D-LC-MS鉴定发现其主要活性成分为凝集素、热休克蛋白、蒜氨酸酶、半胱氨酸合酶和肿瘤坏死因子受体蛋白。蒜氨酸酶可催化蒜氨酸分解为大蒜素等硫化物，大蒜素目前已经被证明具有广泛的抗菌抗肿瘤作用，目前在临床中已有应用[10-12]。凝集素是一类具有糖专一性、可使细胞凝集的糖蛋白。它能与糖专一性、非共价可逆结合，广泛存在于植物、动物等生物的细胞膜上、细胞质内和细胞外基质中，具有促使细胞凝集、细胞有丝分裂、防御害虫危害、消除入侵微生物等生理功能。目前研究表明凝集素对肿瘤细胞具有凝集作用，凝集素构成的免疫毒素对肿瘤细胞有杀伤作用[13]。文献[14]报道蓖麻毒蛋白能通过诱导DNA断裂，导致细胞凋亡。

随着藠头蛋白质质量浓度的升高肿瘤细胞凝集现象越明显，本实验室此前的研究结果曾报道肿瘤细胞在经过藠头提取物作用后DNA发生断裂[15]，这和文献报道的凝集素对肿瘤细胞的作用结果相似。同时文献[16-17]报道从藠头鳞茎中提取的活性物能通过对肿瘤细胞周期的影响来抑制肿瘤细胞的生长，本实验经质谱鉴定到一些能通过影响细胞周期和调控细胞程序性死亡的蛋白质，可能与藠头活性物具备抗肿瘤活性有关。当然，藠头中各类蛋白质对肿瘤细胞的协同作用机制和对肿瘤细胞周期的影响需要进一步研究。

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Isolation and Antitumor Activity of Proteins from Allium chinense Bulbs

LIU Wei，DING Xue-zhi*， XIA Li-qiu，SUN Yun-jun，YU Zhi-hui，XIAO Xiu-qing，LUO Chao-zhi，HUANG Shao-ya
(Key Laboratory of Microbial Molecular Biology of Hunan Province, College of Life Science, Hunan Normal University, Changsha 410081, China)

Allium chinense bulbs were extracted with pH 7.5 100 mmol/L Tris-HCl buffer solution and salted out with ammonium sulfate at different degrees of saturation to obtain total proteins. The antitumor activity of total protein extracts against mouse B16 melanoma cells and Meth-A cells was tested. Protein extracts obtained with 20%ü80% saturated ammonium sulfate had potent cytotoxicity against both tumor cells and protein extract with the most potent cytotoxicity was obtained with 80% saturated ammonium sulfate, which mainly consisted of alliinase, heat shock protein, lectin, cysteine synthase and members of the tumor necrosis factor receptor super family as shown by LC-MS analysis.

Allium chinenese；protein；melanoma；anti-tumor；LC-MS

TS201.2

A

1002-6630(2013)01-0300-03

2011-10-19

湖南省科技计划项目(2010 FJ 2002)；长沙市科技计划项目(k0802102-31)

刘巍(1986ü)，男，硕士研究生，主要从事微生物生物化学研究。E-mail：koosy2000@163.com

*通信作者：丁学知(1954ü)，女，教授，博士，主要从事生物化学与分子生物学研究。E-mail：dingxuezhi@hunnu.edu.cn