低温低氧复合应激对大鼠肺微血管内皮细胞的损伤作用研究*

张竞丹，杨丹凤，曹燕卿，李 曦，安玉林，刘嘉瀛，汪 海

（1.中南大学公共卫生学院，湖南长沙410078；2.军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津300050）

高原肺水肿（high altitude pulmonary edema，HAPE）是高原病中最具有代表性的一型，比较常见且发病急骤，病死率较高。关于诱发高原肺水肿的机制尚不完全清楚，较为肯定的有血液动力学改变、体液潴留和循环障碍等［1］。一般认为机体缺氧引起肺小动脉收缩而产生的肺动脉高压和血管内皮细胞损伤是高原肺水肿发生的基本原因［2］。而寒冷对高原肺水肿发生的影响的研究甚少。本文采用2×2析因设计［3］，通过观察低温和低氧对大鼠肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs）在细胞膜通透性和血管活性物质变化方面的影响，以及二者之间的协同作用，以探讨低温和低氧两个因素在高原肺水肿发生中所起的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

主要试剂：高糖DMEM培养基、胰蛋白酶、I型胶原酶（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国 Hyclone公司）；内皮细胞生长添加剂 ECGS（Upstate公司）；肝素（Amresco公司）；中性蛋白酶、DMSO、MTT、明胶（美国SIGMA公司）；内皮细胞鉴定试剂盒（武汉原生代生物医药科技有限公司）；TRIZOL、PCR引物（美国 Invitrogen公司）；PCR相关试剂（天根生化科技有限公司）；LDH、SOD、MDA、NO检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

主要仪器设备：三气培养箱（美国 Thermo公司），显微摄像系统（成都仪器厂），电子天平、酶标仪（瑞士 Tecan公司），PCR仪（美国 Biorad公司）。

1.2 PMVECs的培养、传代及鉴定

参照相关文献［4］，选用体重 100～130 g的健康雄性Wistar大鼠，颈椎脱臼法处死后，迅速打开胸腔，左心耳剪一小口，从右心室注入 15～25 ml DMEM培……