水产饲料用寡肽豆粕制备工艺的研究

宋永康 黄 薇 姚清华 林香信 林 虬

(福建省农业科学院中心实验室福建省精密仪器农业测试重点实验室，福州 350003)

水产动物不同于畜禽等单胃动物和反刍动物，其对营养物质的需求、摄取、消化与吸收等方面都有其特性。以鳗鲡为例，其饲料不仅要求具有良好的诱食性、营养性，还需要具有良好黏弹性即蛋白原料与α－淀粉的亲和性[1]。近年来水产养殖业发展迅猛，水产饲料蛋白源匮乏日趋严重，寻找和开发新的饲料蛋白源已成当务之急。随着寡肽吸收理论的提出及其生理功能特性认识的加深，运用酶解技术提高植物蛋白品质使其替代鱼粉等动物源性蛋白已成为当前研究的热点[2－3]。大量研究表明，豆粕经酶解制备的大豆多肽具有众多有利于动物生长的功能和特性，应用在饲料中不仅能够降低成本，并且可以提高动物的生产性能以及免疫力[4－6]。Rerat等[7]的研究显示，小肽吸收是逆浓度梯度转运过程，与游离氨基酸相比，具有耗能低、不易饱和、吸收速度快等特点。

目前，国内外对豆粕酶解研究主要集中在抗营养因子的去除或钝化、蛋白质的改性以及酶解产物的生物学功能性上，追求高水解度，对酶解产物的加工性能关注较少[8－12]。肽蛋白的营养特性和加工性能与其水解方式和水解程度有密切的相关性，因此必须对水解过程进行严格控制[13]。以水解度(DH)为指标，易引起过度水解，导致部分寡肽被彻底水解成游离氨基酸，影响水解产物的加工性能；以酸溶蛋白(或TCA－N)为指标，其结果是反映分子质量小于10 ku的可溶性肽[14]，易造成水解不足，导致饲料的消化率降低；水解不足或过度均不能达到理想效果。本研究首次提出以寡肽得率(分子质量≤2 ku)为指标，同时与水解度进行比较，优化 Alcalase和 Flavourzyme双酶同步水解制备寡肽豆粕的工艺，并对两种指标制备的产品进行加工质量指标分析评价，旨在探讨豆粕水解进程对水产饲料加工性能的影响，为促进豆粕在水产特种养殖业上的有效利用以及提高豆粕产品质量提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豆粕(粗蛋白含量46.12%):福州科汇生物技术有限公司；Alcalase(活力 380 000 U/mL)、Flavourzyme(活力 430 000 U/mL):丹麦 Novozymes公司；十二烷基磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT):合肥新恩源生物技术公司；对苯二甲醛(OPA)、单宁酸、甲醛、氢氧化钠、盐酸等试剂:国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要设备

Kjeltec 2300自动定氮仪:瑞典Foss有限公司；HJ－3恒温磁力搅拌器、3HA－C恒温振荡器:常州国华电器有限公司；TD5A－WS离心机:长沙湘仪离心机仪器有限公司；AL204电子分析天平:梅特勒－托利多(上海)有限公司；PHS－3C pH酸度计:上海精密科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 水解度的测定

水解度(DH，Degree of Hydrolysis)的定义是指蛋白质水解过程中，被断裂的肽键数h(mmol/g蛋白质)与给定蛋白质的总肽键数htot(mmol/g蛋白质)之比。水解度的测定方法采用邻苯二甲醛(OPA)法[15]，其计算公式为:DH＝h/htot×100%。

1.3.2 寡肽得率的测定

寡肽含量采用单宁酸沉淀法并参考 DB35/T 1089—2011进行测定，通过凯氏定氮法测定经16%单宁酸沉淀后滤液中的寡肽与游离氨基酸总含量，再用甲醛滴定法测定滤液中游离氨基酸的含量，计算两者的差值即为寡肽的含量。其计算公式为:寡肽得率＝(单宁酸溶蛋白含量－游离氨基酸含量)/总蛋白×100%。

1.3.3 黏弹性评价

黏弹性参照SC/T 1047—2001中规定的方法测定，称取经粉碎(通过80目)寡肽豆粕38 g与12 g的α－淀粉混均，加入55 mL蒸馏水，在(25±2)℃下，拌和均匀，拉伸20次。

1.3.4 溶失率的测定

参照SC/T 1047—2001中规定的方法测定溶失率。按照1.3.3方法处理两组样品，取一组放置静水中，在水温(25±2)℃下浸泡1 h，捞出后与另一组对照样品同时放入烘箱中，105℃恒温烘至恒重，冷却后分别准确称重。其计算公式为:溶失率＝(对照料烘干质量－浸泡料烘干质量)/对照料烘干质量×100%。

1.3.5 工艺路线

称取粉碎豆粕置于反应杯中，按一定比例加水匀浆，放置90℃水浴锅中浸提15 min，用氢氧化钠或者盐酸调节体系pH至酶的最适pH，加入一定量的蛋白酶，在适当温度下恒温酶解，反应结束后，取出样品溶液置于沸水浴中灭酶15 min，5 000 r/min离心10 min，所得上清液测定寡肽得率、DH后进行烘干、粉碎，所得样品即为寡肽豆粕，取适量用于黏弹性评价和溶失率测定。

1.3.6 正交试验设计

根据单因素试验结果，固定酶活力比(Alcalase:Flavourzyme)为 2∶1，考虑底物浓度、加酶量、反应pH、反应温度以及酶解时间等因素对豆粕寡肽得率的影响，选择5因素4水平进行L16(45)正交试验，优化各因素组合。正交试验因素和水平见表1。

表1 正交试验因素与水平

1.4 数据处理

正交试验结果采用SAS9.0进行极差和方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酶解时间对寡肽得率和DH的影响

在底物浓度10%、酶浓度2 000 U/g、Alcalase与Flavourzyme酶活力比1∶1、pH 8.0、温度50℃的条件下，测定不同的酶解时间对豆粕寡肽得率和DH的影响(图1)。在0～8 h的酶解过程中，体系DH和寡肽得率均不断增加；当水解时间达到8 h时，寡肽得率达到最大；8 h后DH继续升高而寡肽得率降低。这可能是Flavourzyme包含有内切肽酶和外切肽酶两种活性，不仅作用于肽链内部的肽键，而且作用于肽链外部的肽键，较长的酶解时间导致了部分寡肽被彻底水解成游离氨基酸。因此，确定适宜的酶解时间为8 h。

图1 酶解时间对寡肽得率和DH的影响

2.1.2 底物浓度对寡肽得率和DH的影响

在酶浓度2 000 U/g、Alcalase与 Flavourzyme酶活力比1∶1、pH 8.0、温度50℃的条件下酶解8 h，测定不同底物浓度酶解后的豆粕寡肽得率和DH(图2)。随着底物浓度的增加，水解度和寡肽得率逐渐降低；当底物浓度大于10%时，水解液离心分离后溶液浑浊不清。这是由于底物浓度过高，体系流动性较差，不利于蛋白质的充分溶解和分散，酶与底物的接触机会也逐渐降低。底物浓度不仅影响DH和寡肽得率，而且直接决定生产成本，生产中应尽量提高底物浓度。综合考虑生产成本和酶解效率，确定底物适宜浓度为10%。

图2 底物浓度对寡肽得率和DH的影响

2.1.3 pH对寡肽得率和DH的影响

在底物浓度10%、酶浓度2 000 U/g、Alcalase与Flavourzyme酶活力比1∶1、温度50℃、酶解时间8 h的条件下，测定不同pH值对豆粕寡肽得率和DH的影响(图3)。pH值在6.0～10.0的范围内，寡肽得率和DH的变化呈相似趋势，均为先增大之后再减小，在pH 8.0时达到最高。酶的催化能力与pH密切相关，环境pH值能够影响酶分子的构象和酶与底物的解离状态，从而影响酶的催化反应速率和酶与底物的结合，过高或过低均对酶促反应不利。因此选定8.0作为水解的最适pH。

图3 pH对寡肽得率和DH的影响

2.1.4 温度对寡肽得率和DH的影响

在底物浓度10%、酶浓度2 000 U/g、Alcalase与Flavourzyme酶活力比 1∶1、pH 8.0、酶解时间 8 h的条件下，测定不同温度对豆粕寡肽得率和DH的影响(图4)。当反应温度较低(45～55)℃时，体系寡肽得率和DH随温度升高而逐渐上升，并于55℃时达到最大值；相反地，当反应温度较高(55～65)℃时，则体系寡肽得率和DH随温度升高而逐渐下降。在温度较低时，温度升高能加剧蛋白质分子的扩散使得酶促反应加快，但过高的温度易引起维持酶分子结构次级键解体，导致酶失活速率加快。故确定最适反应温度为55℃。

图4 反应温度对寡肽得率和DH的影响

2.1.5 酶活力比对寡肽得率和DH的影响

在底物浓度 10%、酶浓度2 000 U/g、pH 8.0、温度55℃、酶解时间8 h的条件下，测定Alcalase与Flavourzyme酶活力比对豆粕寡肽得率和DH的影响(图5)。结果表明，酶活力比对豆粕寡肽得率影响不明显。当 Alcalase与 Flavourzyme酶活力比为2∶1时，体系寡肽得率和DH最大。因此，后续的双酶同步水解试验，选取Alcalase酶与Flavourzyme酶活力比为 2∶1。

图5 酶活力比对寡肽得率和DH的影响

2.1.6 加酶量对寡肽得率和DH的影响

在底物浓度10%、Alcalase与Flavourzyme酶活力比为2∶1、pH 8.0、温度55℃、酶解时间8 h的条件下，测定不同加酶量对豆粕寡肽得率和DH的影响，结果见图6。结果表明，加酶量在400～3 200 U/g范围内，寡肽得率与DH随加酶量的增加而快速上升，当加酶量达到3 200 U/g时，再进一步增加酶用量，寡肽得率与DH增幅不明显，此时酶分子与底物分子接触饱和，转化效率达到最大，因而寡肽得率基本不再变化。综合考虑酶解反应过程，选用加酶量3200 U/g较为适宜。

图6 加酶量对寡肽得率和DH的影响

2.2 正交试验

L16(45)正交组合试验结果与分析见表2和表3。由表2极差R可知，影响豆粕寡肽得率大小顺序为:A＞B＞D＞C＞E，而影响豆粕DH的各因素主次顺序为:C＞D＞A＞B＞E，这说明各因数对豆粕寡肽得率和DH的影响次序有差异。方差分析结果表明(表3):寡肽得率模型的P值小于0.01，复相关系数R2＝0.978，校正决定系数AdjR2＝0.958，表明寡肽得率模型为满意模型，除酶解时间影响显著外，其他因素对寡肽得率的影响均极显著(P＜0.01)；DH模型的P值小于0.01，同样表明该模型为满意模型，各因素对DH的影响极显著(P＜0.01)。

在所选因素水平下，寡肽得率的最佳组合为A1B2C3D4E2，即底物浓度 8%、加酶量 3000U/g、pH 8.0、温度61℃、酶解时间7.5h。在该组合条件下，豆粕寡肽得率为38.16%，DH为22.69%。而在DH的最优组合A1B3C4D3E2，即底物浓度8%、加酶量3200U/g、反应 pH8.5、反应温度 58℃、酶解时间7.5h。在该组合条件下，DH升至26.93%，寡肽得率降为32.21%，因此选用不同的参数指标对水解的产物关系密切。

表2 正交试验设计及结果

表3 方差分析表

2.3 寡肽豆粕的加工质量指标

在寡肽得率最佳组合A1B2C3D4E2和DH最优组合A1B3C4D3E2条件下水解豆粕，产物经烘干、粉碎，制成两种寡肽豆粕产品，对其黏弹性进行评价并测定溶失率。DH最优组合的产品黏弹性和伸展性欠佳，展开成薄状有裂痕，按凹后不能完全反弹复原且会黏手，溶失率高达(6.8±0.9)%，超过 SC/T 1077—2004渔用配合饲料粉料溶失率≤5%的要求。寡肽得率最佳组合的产品具有良好的黏弹性和伸展性，经拉伸后体积明显膨胀，能承受压力，展开成薄状均匀有序，按凹后很快反弹复原且不黏手，溶失率仅为(2.5±0.7)%，表明该产品与α－淀粉具有较佳的亲和性，能够满足特种水产饲料加工质量指标要求。

3 结论

3.1 选用Alcalase和Flavourzyme对豆粕进行同步酶解，体系寡肽得率与加酶量、反应pH及反应温度显著相关，体系DH与加酶量、反应pH、反应温度及酶解时间显著相关，寡肽得率模型和DH模型均为满意模型。

3.2 确定Alcalase与Flavourzyme同步酶解制备寡肽豆粕的最佳工艺条件为:酶活比(Alcalase:Flavourzyme)2∶1、加酶量 3 000 U/g、底物浓度 8%、反应pH 8.0、反应温度61℃、酶解时间7.5 h。在此条件下水解豆粕，DH为22.69%，寡肽得率可达38.16%。

3.3 建立了以寡肽得率为控制参数的双酶同步法制备寡肽豆粕的工艺条件，解决了蛋白酶解过程中水解不足或过度问题。制备的寡肽豆粕粉与α－淀粉具有较好的亲和性，散失率仅为(2.5±0.7)%，质量指标能达到特种水产饲料加工要求。

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