基于偏最小二乘法的磷脂红外快速检测

丁 洋 魏 敏 孟祥河

(浙江工业大学生物与环境工程学院，杭州 310014)

磷脂是一种重要膳食成分，广泛存在于大豆、菜籽、葵花籽等油料作物中，在大豆油中，磷脂的质量分数约为0.1%～1.8%，脱胶以后磷脂的含量约为20 mg/kg[1]。目前，磷脂含量的检测方法主要有钼蓝比色法[2]，重量法[3]，紫外分光光度法[4]，高效液相色谱法[5－6]，薄层色谱法[7－8]和31P核磁共振光谱法[9－10]等，其中常用的检测方法如高效液相色谱法可对磷脂单体进行准确定量，但成本昂贵，而且复杂的样品富集前处理同样不可或缺。总磷脂的测定常采用钼蓝比色法，问题是需要耗费大量的时间，并且非磷脂磷会带来较大的误差。

近些年来，随着化学计量学的研究应用，傅里叶变换红外光谱仪在物质成分的定量分析中逐步得到了广泛的应用。Christoph Krafft等[11]利用近红外、拉曼光谱分析了人脑的磷脂组成及各基团的特征吸收峰，但是没有进行定量研究。Nzai等[12]利用中红外光谱法测定了大豆毛油中磷脂的含量，采用朗伯－比尔定律的方法建立标准曲线，发现相对于传统的磷分析技术具有快速、简单、稳定的优点，但其背景如何扣除不清楚，方法的准确性和精确性均不高。Kuligowski等[13]利用凝胶色谱法结合衰减全反射红外光谱(FTIR－ATR)研究了大豆油中卵磷脂的含量，但是ATR灵敏度低，不适用于低浓度磷脂的检测，并且检测之前需要凝胶色谱预分离，不能直接对油中的磷脂进行检测，Aleksandra Szydlowska－Czerniak[14]利用中红外光谱结合偏最小二乘法对生产过程中各阶段菜籽油中磷脂的含量进行了检测，研究发现，中红外光谱在860～1 760 cm－1波数范围内能够很好的确定磷脂的含量，但其方法需要以相应的脱磷脂油作对照，因此使得FTIR/PLS方法样品处理复杂化。

本研究以大豆油，葵花油和菜籽油为代表进行综合分析，运用偏最小二乘法建立定量分析模型，样品只需正己烷溶解即可，省去了脱胶油作为对照的必要性，方法简便、快速，效果良好。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

正己烷:色谱纯Sigma－Aldrich公司；大豆磷脂:广州市海圣生物科技有限公司，通过钼蓝比色法测定其磷脂的含量为911.59 mg/g；精炼大豆油、葵花油、菜籽油:一级精炼油，市售；其他试剂均为分析纯。

Tensor 27傅里叶变换红外光谱仪:德国Bruker公司；可见分光光度计:日本岛津公司；微波炉:格兰仕公司；马弗炉:上海意丰电炉厂。

1.2 样品的制备

大豆油、葵花油和菜籽油经硅胶柱过滤，去除其残余的微量磷脂。精确称取大豆磷脂(精确到0.01g)分别溶解在经硅胶柱过滤的3种油中，用微波炉加热60 s，振荡混匀，制成 200～20 000 mg/kg的磷脂－大豆油/葵花油/菜籽油混合液，精确称取上述混合液1.00 g，用正己烷稀释至5.00 g。

1.3 方法

1.3.1 钼蓝比色法测量磷脂的含量

钼蓝比色法采用 GB5537—2008[15]中的方法，植物油中的磷脂经灰化后变为五氧化二磷，后被盐酸变为磷酸，遇钼酸钠生成磷钼酸钠，然后被硫酸联氨还原成钼蓝，用分光光度计在波长650 nm处测定钼蓝的吸光度，与标准曲线比较计算磷脂的含量。

1.3.2 傅里叶变换红外光谱参数设定及样品光谱采集

Bruker Tensor 27傅里叶变换红外光谱仪，检测器为RT－DLaTGS，采用100μm CaF2液体样品池。样品的光谱采集范围是400～4 000 cm－1，光谱分辨率是2 cm－1，以空气作背景，背景和待测样品均扫描16次。

样品光谱采集选用透射的方式，室内温度控制在25℃，湿度保持恒定，每次测量样品红外光谱前，样品池用正己烷清洗4次，然后用待测样品润洗3次，每个样品测量2次，取其平均值作为测量的结果。共得到红外光谱212个，其中大豆油116个，葵花油41个，菜籽油55个。

2 结果与分析

2.1 磷脂红外谱图的分析

从图1可以看出，其红外光谱图在800～1 300 cm－1，1 300～1 520 cm－1，1 700～1 780 cm－1波数范围内具有明显的吸收峰，在2 600～3 100 cm－1范围内具有较宽的吸收峰，其中2 600～3 100 cm－1，1 410～1 570 cm－1为磷脂和三酰甘油中C—H基团的反对称和对称伸缩峰，1748 cm－1处为C＝O的伸缩峰，与磷相关的基团的吸收峰主要集中在800～1 300 cm－1(图1a，图1b)，其中1 246 cm－1为 PO2的不对称伸缩峰，1 035 cm－1为P—O—C的对称伸缩峰，1 162 cm－1为 C＝O—O—C中 C—O的伸缩峰，1 066 cm－1处为C—O—PO2中C—O—P的不对称伸缩峰。然而，CH3，CH2，C＝O和 C—O—C在植物油和磷脂中共同存在，但是由于磷脂中一个磷酸基团替代了普通甘油酯中的一个C—O—C和C＝O基团，C—O—C和C＝O的峰高会随着磷脂含量的增加而减少。P＝O，PO2，P—O—C为磷脂中特有的特征吸收峰，它们的峰高会随着磷脂含量的增加而增加。在建立磷脂的定量分析模型中，选用800～1 300 cm－1波数范围的吸收峰。

图1 磷脂的傅里叶变换红外光谱图

2.2 异常样品的去除

由于人工操作或者仪器环境等原因，通常会产生一些异常样品，在红外光谱的测量中通常会存在两类异常样品，一类是样品化学值比较极端，影响模型预测的准确性，但一般能提高模型的适应能力，这类异常样品可以用马氏距离(杠杆值)来剔除。另一类就是测量样品的参考测量值有误，其误差范围超出了标准的规定范围，该样品不能用于模型的建立，这类异常样品可用学生残差予以剔除。如果样品的化学值确实准确无误或者该样品对模型的准确度影响不大，那么马氏距离判定的异常样品在一般情况下不予剔除，这样可以保证模型的广泛适用性，学生残差判定的异常样品一般需要剔除。

图2 磷脂样品红外光谱的马氏距离排序图及学生残差分布图

本试验异常样品的去除是通过马氏距离结合学生残差进行的，图2为其马氏距离排序图和学生残差值分布图。从图2中可以看出，782.03 mg/kg和899.33 mg/kg这两个质量浓度的样品的马氏距离高于其他样品，同时这两个样品的学生残差较大，因此认定这两个样品为异常样品，在建模的过程中予以去除，其他样品马氏距离较小，学生残差分布集中，因此作为有效样品应用于建模分析。

2.3 模型的建立与优化

2.3.1 建模样品的选择

在待测样品中随机挑选141个样品作校正集，最小质量浓度213.28 mg/kg，最大质量浓度19 967.73 mg/kg，平均质量浓度是 7 038.79 mg/kg。其余的 69个样品作为验证集，最小质量浓度445.97 mg/kg，最大质量浓度 18 642.50 mg/kg，平均质量浓度是7 449.30 mg/kg。

2.3.2 光谱预处理对建立模型的影响

采用TQ Analyst红外定量分析软件对测得的红外光谱进行预处理及分析，通过适当的预处理，可以减弱以至消除各种非目标因素对光谱的影响，净化谱图信息，为校正模型的建立、未知样品组成或性质预测奠定一定的基础。预处理过程包括SNV、一阶导数、二阶导数、卷积平滑等[16]，通过分析不同预处理方法对模型各性能的影响确定合适的预处理方法。表1为偏最小二乘回归结合不同的预处理方法建立红外定量分析模型的分析结果。

表1 基于偏最小二乘结合不同的预处理方法建立磷脂含量模型的分析

从表1中可以看出采用原始光谱、SNV、9阶平滑处理的效果好于其他样品预处理的方法，其主成分数都为10，相关系数R2分别为0.995 2、0.996 8和0.996 1。在后续的分析过程中将对原始光谱，SNV和9阶平滑处理得到的光谱进行比较。

2.3.3 波数范围及主成分数对建立模型的影响

偏最小二乘法是一个全光谱的方法，然而在有些情况下，光谱噪声或者样品中出现的附加组分会造成PLS算法解析这些特征，从而使模型的稳定性降低。这时就需要选择PLS回归的频率范围，并使谱图包含所有的特征官能团，磷脂的特征吸收峰主要集中在800～1 300 cm－1波数范围内，因此在选择建模的波数范围时，这个波数范围将重点考虑。表2列出了不同波数范围对建立模型的分析结果。

表2 基于偏最小二乘回归结合不同波数范围所建磷脂含量模型的分析结果

从表2的数据中可以看出，970～1 320 cm－1波数范围内所建的模型性能最好，主成分因子数较低，相关系数均达到0.99以上，RMSEC和RMSEP均较小。在这个波数范围内主要是磷脂中与P—O—C，PO2，P＝O等与磷有关的基团的特征吸收峰，受其他成分的干扰较少，并且根据朗伯－比尔定律，其吸光度随磷脂含量的增加而增加，有很好的线性关系，因此所建模型最好。除与磷有关的特征峰以外，磷脂中的另一个特征基团就是1 710～1 780 cm－1范围内的羰基的吸收振动峰，经分析，由于磷脂中含有的羰基少于油脂中的羰基，所以羰基的吸收峰随着磷脂含量的增加而减少，但是采用这个波数范围建立的模型效果并不好，原因可能是油中的羰基含量太高而磷脂的含量对它的影响很小，或者可能是这个波数范围太窄，不能包含磷脂红外光谱的所有信息。同样，970～1 320 cm－1结合1 710～1 780 cm－1同样受到C＝O的影响，导致结果不理想，另外采用全波数建模相关系数较差，并且RMSEC和RMSEP均较大，原因可能是建模过程中无用的信息太多，影响了建模效果。

另外，采用PLS法建立定量分析模型时，主成分数的选择将直接影响到模型的预测能力。使用的主成分数过多，会引入一些噪音，使用的主成分数过少，则不能充分反映样品的光谱信息，这都将降低模型的预测能力，本次分析通过留一交互验证法，当交互验证均方差(RMSECV)和预测残差平方和(PRESS)均较小时，所选主成分数最好。通过分析在970～1 320 cm－1波数范围内，SNV，9阶平滑处理的光谱和原始光谱的主成分数分别为4、5、5。

结合光谱的预处理可以得到，经SNV处理的红外光谱，在970～1 320 cm－1波数范围内建立的模型为最优化模型。其主成分数为4，相关系数R2为0.997 9，RMSEC和 RMSEV分别为316、386。

2.4 模型的验证

2.4.1 FTIR/PLS模型准确值和预测值之间的相关关系

图3给出了200～20 000 mg/kg范围的最优模型的准确值和预测值之间的相关关系，从图中可以看出，样品的准确值和预测值之间的线性回归系数达到0.997 9，预测值和准确值之间的关系吻合良好，表明此模型能够很好的预测样品中磷脂的含量。

图3 FTIR/PLS模型准确值和预测值之间的相关关系图

2.4.2 FTIR/PLS法同钼蓝比色法测量结果的比较

为了验证FTIR方法的有效性，选择精炼菜籽油，精炼葵花油，大豆毛油，菜籽毛油和经过稀释的磷脂浓缩物5个样品，用FTIR/PLS法和钼蓝比色法分别测其磷脂的含量，各测5次，结果见表3所示。

表3 FTIR/PLS法同钼蓝比色法测量结果的分析

如表3所示，钼蓝比色法的相对标准偏差为1.48%～3.87%，平均相对标准偏差为2.47%，而FTIR测得的磷脂含量的相对标准偏差为1.42%～3.52%，平均相对偏差为2.36%。两者的平均相对误差为0.75%，表明FTIR法能够代替钼蓝比色法实现植物油中磷脂的快速检测。

3 结论

本研究采用了添加大豆磷脂的方式制备样品，制备的样品中包含大豆油、葵花籽油、菜籽油，采用偏最小二乘法建立定量分析模型，选用的化学计量学方法可解析谱图中的特征吸收峰，提取有用信息，降低不同品种油中磷脂组成不同对结果的影响。由结果可知，精确度和准确度相对较高，线性关系和适用性良好，与HPLC，钼蓝比色法等相比简单快速，不需要复杂的样品处理过程，该方法适合不同磷脂含量(200～20 000 mg/kg)油脂样品的快速检测。

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