皮肤间充质干细胞在促进皮肤愈合中的作用

吴 实，邓列华

干细胞在疾病治疗、发病机制的研究等方面具有很大的潜能。间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）作为成体干细胞，在干细胞治疗疾病的发展中有很大的应用前景。皮肤间充质干细胞（SMSCs）具有MSCs 的特性，并因其自身的易获得性，逐渐成为皮肤病学研究的热点。本文就MSCs 特性以及其在皮肤愈合中的应用前景进行综述。

1 MSCs

目前，MSCs 的分离、纯化技术几近成熟，通过标准化实验室方法，可较容易获得MSCs。MSCs 具有多种功能，其向中胚层（脂，骨，软骨母细胞）细胞系多向分化特性和免疫抑制特性[1]最具研究价值及应用前景[2]。

1.1 MSCs的转分化功能

骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）具有向软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞、内皮细胞等细胞系分化的能力。Lohberger 等[3]研究表明，口腔内MSCs 在二维和三维培养环境中具有多向分化潜能，MSCs 符合干细胞与组织工程学中关于上颌面功能重建的要求，因此其在此类疾病的治疗中具有较好的应用前景。

1.2 MSCs的免疫抑制性

Lohberger 等[3]已报道证实绝大多数MSCs 均具有相同的免疫表型（CD73、CD90 和CD105），但不表达CD45、CD34、CD14、CD11 和人类白细胞抗原-DR（HLA-DR）。

MSCs 源性树突状细胞具有免疫抑制功能，Zhao等[4]研究表明，BM-MSCs 能将成熟的树突状细胞分化成特殊调控的树突状细胞群，MSCs 诱导的树突状细胞难以刺激T 细胞的增生。Xu 等[5]研究表明，在体外由MSCs 衍生而来的细胞能抑制T 细胞抗原受体（TCR）激活-诱导的T 细胞增生。从MSCs 培养中得到的条件培养液具有抗CD3 效应。另外，MSCs能通过可溶性因素和细胞间接触来发挥其免疫抑制作用。

Han 等[6]研究发现，MSCs 在体外能抑制主要和次要的同种免疫反应。主要同种免疫反应中，MSCs能抑制细胞因子的产生和增生。它们在体外也抑制CD44+记忆T 细胞的增生和产生。另外，MSCs 在鼠皮肤移植模型中抑制同种异体移植排斥。

Pradier 等[7]研究发现，在受伤组织中有活性的MSCs 对炎症反应和免疫细胞具有免疫抑制潜能， MSCs 可分泌可溶性递质，如NO、前列腺素E2、吲哚胺2,3-双加氧酶和白介素（IL）-6，这些能抑制T 细胞的增生和B 淋巴细胞向浆细胞分化，保护细胞毒T 细胞的产生及干扰树突状细胞的分化和成熟。

2 SMSCs

SMSCs 是MSCs 中的一种类型，相比于表皮和毛囊，真皮也许是成体干细胞最大的储存器[8]。MSCs 来源于皮下组织，并具有多向分化潜能[9]，这使SMSCs 成为皮肤病学近年的研究热点之一。

2.1 SMSCs的基本特性

2001 年， Toma 等[10]首次对SMSCs 进行研究，并第一次从真皮层中分离多功能成体干细胞，这些细胞可在体外分化为脂肪细胞、平滑肌细胞等。SMSCs是间充质干细胞的一种，其基本特性为转分化和免疫抑制。

2.2 SMSCs的培养与分离

Park 等[11]对4 例患者行头颈部手术，在中下颌处获得1 块5 cm×2 cm 大的椭圆形皮肤样本，在剔除毛发及皮下脂肪组织后，将表皮与真皮组织剪成1 ～3 mm2的外植体，并将外植体加入1 ml 的DME 培养基（DMEM）/F12（1∶1）中。培养基中还添加了10%的小牛血清、10 ng/ml 表皮生长因子、10 ng/ml 基础成纤维细胞生长因子、100 U/ml 青霉素和100 mg/ml 链霉素。将培养基在37 ℃含有5%CO2的组织培养箱中放置3 ～5 d。移除非贴壁细胞和组织，每周换液2 次。当贴壁细胞有80%群集时可进行分离[12]。Park 等[11]运用0.25%（w/v）胰蛋白-乙二胺四乙酸进行分离后，加入含有10%FBS、100 U/ml 青霉素和100 mg/ml 链霉素的ADME 培养基（ADMEM）中，将培养基放置在37 ℃含有5%CO2的组织培养箱中，每周换液2 次，传代3 次后便可进行分离。

2.3 SMSCs的分子标志

Campanati 等[13]从银屑病患者皮肤样本中分离出MSCs，研究发现这些MSCs 有着间质样细胞的免疫表型，其中HLA-ABC、CD73、CD90 和CD105阳性， 而HLA-DR、CD14、CD19、CD34 和CD45阴性。Vaculik 等[14]研究发现SMSCs 经免疫组化染色后，表达CD73/CD90/CD105、CD271 和SSEA-4表型。所以可以运用CD271 和SSEA-4 表型来分离成纤维细胞和SMSCs。另外皮肤CD271 高表达的人群中SMSCs 分化成脂肪、成骨和软骨形成细胞的潜能是增加的。相反，SSEA-4 高表达的人群中SMSCs分化成脂肪形成细胞的潜能是减弱的。这就说明具有不同分化潜能的特定细胞群可从人类皮肤中分离出来。

3 SMSCs在皮肤修复中的研究前景

3.1 SMSCs与BM-MSCs在皮肤修复中的相似性

SMSCs 和BM-MSCs 均为MSCs，有着相似的形态、相同的免疫表型以及分化成多种间质细胞系的潜能。Ock 等[15]将猪的BM-MSCs 与人耳和胎儿SMSCs 进行比较，结果显示两者的磷酸酶活性、分化能力、Oct-4、Sox-2 蛋白的表达和mRNA 水平相似。BM-MSCs 比SMSCs 的细胞周期长，但是两者的G0/G1 并没有明显的区别。除了CD29 和CD90，绝大部分细胞均能表达CD45。Vaculik 等[14]通过流式细胞仪分析显示，SMSCs 的显型与BM-MSCs 的显型相似。

BM-MSCs 虽常用于皮肤愈合治疗的研究[16]，但BM-MSCs 需行骨髓穿刺才能获得细胞，而SMSCs仅需通过皮肤组织活检便可获得皮肤样本细胞。因此，SMSCs 较BM-MSCs 容易获得，且两者均是MSCs，具有很强的相似性。SMSCs 的易获得性为SMSCs 在皮肤修复研究中的应用提供了很好的实验基础。

3.2 BM-MSCs在皮肤修复中的研究现况

皮肤愈合是指损伤皮肤局部组织细胞增生、分化以及细胞基质形成的过程。Li 等[17]报道称内源性BM-MSCs 能向损伤部位移行并参与修复过程。在移行过程中BM-MSCs 能产生调控因子、信号分子（包括受伤部位的化学趋化因子）等。转化生长因子（TGF）-β 与碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的协同作用能促进BM-MSCs 向创伤部位的移行和聚集[18]。另外，Xu 等[5]研究发现如果将少量MSCs 注入小鼠体内，这些细胞能促进异体移植皮瓣的存活。

3.2.1 促进表皮生长及血管增生 Kuo 等[19]建立糖尿病小鼠模型，并在小鼠背部皮肤形成6 cm×5 cm的损伤，再给予BM-MSCs治疗。与对照组相比，经过BM-MSCs治疗后的实验组小鼠伤口面积变小，且完全愈合时间缩短。组织学研究发现实验组小鼠皮损局部炎症反应减少，CDE45表达受到抑制。组织病理学显示实验组小鼠的表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、脯氨酰4-羟化酶和抑制常数-67表达均为强阳性。

急性皮肤全层皮肤损伤（FTSW）是指有大范围的烧伤或是高能量引起的皮肤创伤，但目前的临床疗效尚不理想。Ma 等[20]建立的小鼠FTSW 模型中，BM-MSCs 能促进创伤的愈合，植入BM-MSCs 的小鼠，其损伤部位的上皮边缘向内生长，并且有胶原形成。角蛋白10 和角质纤丝聚集蛋白的聚集显示，BM-MSCs 在创伤部位参与了表皮分化的早期及中期阶段。

皮肤放射综合征（CRS）是指对暴露部位皮肤进行高剂量电离辐射后产生的迟发性损伤。Agay 等[21]建立 CRS 小型猪模型，将小型猪在高剂量电离辐射下照射81～222 d后，均能模拟人类CRS潜伏期表现，即早期红斑、脱发和干燥（潮湿）脱屑。BM-MSCs能促进淋巴细胞在CRS 小型猪皮损真皮和（或）皮下组织交界处聚集，促进血管增生。

3.2.2 软骨的增生及汗腺的增长 在皮肤愈合中，软骨的增生及汗腺的增长也十分重要。在体外模拟内环境条件下，BM-MSCs 能表达α-平滑肌肌动蛋白，并且在软骨发生中出现表面凝集及必要的收缩。另组织病理学显示，BM- MSCs 在培养了14 d 后具有能表达硫酸化的葡糖氨基聚糖类和胶原Ⅱ型的群系。在特殊的培养环境下BM- MSCs 能促进软骨生长[22]。人胚胎皮肤中内在的外胚叶发育不全（ectodysplasin，EDA）和EDA 感受器的表达与汗腺的增长有关，诱导人BM-MSCs 分化成汗腺细胞，并通过EDA 基因的转染来实现汗腺的增生[23]。Cai 等[24]已经证实EDA 基因在汗腺发展中的重要性，转染了EDA 基因的BM-MSCs 能促进汗腺的再生。该作者的研究进一步证实了EDA 改良的间充质干细胞具有对皮肤和皮肤附属器烧伤修复和再生的潜能。

人类BM-MSCs 有加速修复猪和兔伤口的能力[25]。人体细胞在兔体内不会引起任何免疫反应，可能与兔皮肤存在免疫耐受有关。

3.2.3 促进真皮成纤维细胞的增生 皮肤愈合包括伤口早期变化、伤口的收缩、肉芽组织增生、瘢痕形成以及表皮与其他组织再生。肉芽组织的形成是愈合过程中关键的一步。肉芽组织存在的基础是成纤维细胞和新生血管。成纤维细胞随着纤维网迁入创伤部位后，受伤部位的边缘出现表皮再生，在干扰素（IFN）和TGF等调控因子作用下，用于皮肤愈合的胶原、纤维蛋白和其他基质通过成纤维细胞为代表的结缔组织进行合成，逐渐增加的合成胶原能贯穿整个创伤部位，随后成纤维细胞增生逐渐衰减，以调节细胞外基质合成和降解的平衡[26]。所以成纤维细胞是皮肤主要的基质细胞群，它们能通过分泌细胞外基质的前体来保持结缔组织的结构完整。另外，成纤维细胞还可向损伤部位移行。

Smith 等[27]将人类真皮的成纤维细胞与鼠BMMSCs 共培养，在共培养之前，先将成纤维细胞和BM-MSCs 分别单独培养3 d 和11 d，得出BM-MSCs能诱导真皮成纤维细胞的增生，明显增加成纤维细胞的数量。BM-MSCs 能促进成纤维细胞的移行。皮肤抓伤影像显示，在有BM-MSCs 存在的情况下，皮肤抓伤后1 ～3 d，成纤维细胞向抓伤处加速移行，到了第3 天，共培养的成纤维细胞可导致抓伤处伤口完全闭合，而非共培养的至少要4 d，且两组差异具有统计学意义。

MSCs 能对真皮成纤维细胞分泌化学诱导剂。观察到成纤维细胞对MSCs 具有趋化现象。MSCs 能诱导真皮成纤维细胞调整有关细胞外基质稳定和粘附基因的表达。 研究发现，与对照组相比成纤维细胞ITGA7 mRNA水平上调，细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）和MMP11 mRNA水平下调，其差异具有统计学意义，而TGF-β1 与对照组差异无统计学意义。MSCs 是调节真皮成纤维细胞增生、迁移和基因表达的信号来源。

4 结语

目前，MSCs 已被用于皮肤愈合的研究中，基于MSCs 的特性，还可将其应用于皮肤疾病的治疗研究。Campanati 等[13]将两种TNF-α 抑制剂(依那西普和阿达木单抗)作用于银屑病患者皮肤来源的MSCs，以观察其疗效，结果表明接受TNF-α 治疗的患者皮肤样本中的MSCs 比未接受治疗的患者生长慢。Salvolini 等[12]研究发现，人类SMSCs 细胞质表达 VEGF，细胞核表达3 种一氧化氮合酶(NOS)亚型，因此能够分泌VEGF 和NO，它们能促进上皮细胞的增生和增加血管通透性。

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