微小RNA-144的研究进展

赵海苹 罗玉敏

(首都医科大学宣武医院脑血管病研究室，北京100053)

微小RNA(microRNAs，miRs)是目前研究最为广泛的一类内源性非编码小分子RNA，长约21～25个核苷酸，由60～110nt的可形成发夹状的内源性转录前体加工而成。随着核酸高通量测序技术的发展，miRs基因测序与基因芯片、生物信息学中miRs基因及靶基因预测、多种分子生物学实验手段结合，越来越多新的miRs、候选miRs基因以及非保守miRs相继被发现［1］。近年来，研究［2］已证实循环中的 miRs以稳定的形式存在于各种体液包括血浆、尿液中，可以作为疾病特异、敏感的生物标记物。miRs主要与靶mRNA分子的3'非编码区的不完全互补序列结合，通过靶向降解mRNA或抑制mRNA翻译，在转录后水平达到基因沉默效果。miRs广泛参与生物发育，细胞分化、凋亡等多种调控［3］。近年研究［4］表明，miR-144既是红系分化的重要调节因子，也参与肿瘤、心脑血管病等高发病率疾病的发生。已鉴定的哺乳动物miRs，约50%在基因组中成簇存在，并转录为多顺反子的最初转录本［5］。miR-144前体以 miR-144/miR-451簇形式存在，本文针对miR-144在血液病、癌症、神经系统疾病、心脏病等不同系统疾病中的表达变化、作用及机制进行综述。

1 造血系统疾病

MiRs在造血系统发育中的调控作用变得越来越引人注目，目前关于miR-144研究最多的就是其对红系形成的作用。用来研究miRs与红系形成、分化之间关系的几种常用实验体系，包括体外系统如人类胚胎干细胞向红系分化、用化合物诱导K562和UT-7细胞的血红蛋白生成、红细胞生成素处理的正常人或血液病人红系前体细胞，体内系统如斑马鱼胚胎，靶向破坏miRs为研究其在哺乳动物造血系统中的作用提供了有力的工具。

1.1 红细胞生成与贫血

miR-144参与了红细胞表型转变，包括调节早期红细胞的成熟和增生，表达胎儿γ－球蛋白基因和去核等过程［4］。Dore等［6］通过基因互补策略结合基因芯片来鉴定参与红细胞形成的miRs，发现miR-144/miR-451是造血关键转录因子GATA-1的直接靶点;在体内，GATA-1结合远端上游调控原件，激活RNA聚合酶Ⅱ-调节的miR-144/miR-451共同前体转录，敲除斑马鱼胚胎miR-451，则分化为成熟红细胞的能力显著减弱。Papapetrou等［7］研究显示，miR-144/451基因簇在红细胞中是由一个前体转录产生的，慢病毒敲低miR-144或miR-451可显著降低Ter119(+)有核红细胞数量，同时敲低二者作用加强。使用体内一过性报告系统(transient reporter assay in vivo，TRA-In Vivo)，鉴定出羟甲基胆素合成酶(hydroxymethylbilane synthase b，hmbsb)和 krüppel样锌指转录因子(Krüppel-like transcription factor d，klfd)分别是 miR-451和miR-144的潜在靶基因;进一步使用体内生理性转基因报告系统(physiological reporter assay in vivo，PRA-In Vivo)，确定 miR-144真实的靶基因仅为klfd［8］。Fu 等［9］研究显示，miR-144 在斑马鱼胚胎形成过程中特定阶段表达，通过靶向红细胞特异的转录因子klfd抑制胚胎的α－球蛋白而不是β－球蛋白基因表达，而klfd选择性结合在α－球蛋白和miR-144基因启动子区CACCC盒子上激活其转录，形成负反馈环路来调节胚胎α－球蛋白的表达，miR-144—Klfd通路对球蛋白调节的选择性使其有望成为改善地中海贫血治疗的新靶点。Rasmussen等［10］研究显示，miR-144/451表达依赖于Argonaute 2蛋白(Ago2)，miR-144/451簇缺失小鼠表现为晚幼红细胞成熟减少、网织红细胞增生、脾肿大和轻度贫血;miR-451缺失小鼠表型与miR-144/451簇缺失几乎一样。另外，miR-144/451簇在应激条件下调节基因表达对于稳定红细胞生成至关重要。miR-144/451敲除导致红细胞易被氧化剂诱导破坏，miR-144敲除协同氧化应激可导致斑马鱼胚胎严重贫血;miR-451的保护作用通过抑制14－3－3zeta生成，在 miR-144/451(－/－)的有核红细胞，14－3－3zeta堆积，导致部分FoxO3从核转位到胞质，抑制了下游包括抗氧化编码基因Cat和Gpx1的转录;在网织红细胞和成纤维细胞中过表达14－3－3zeta可以抑制FoxO3核转位和活性，而抑制14－3－3zeta可以保护过氧化氢诱导的 miR-144/451(－/－)红细胞损伤，保存过氧化氢酶活性［11］。与此相反，也有研究［12］显示miR-144高表达，镰状红细胞贫血更加严重，其机制为靶向下调核因子 E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，NRF2)，从而降低谷胱甘肽的产生，降低红细胞的抗氧化能力，阐明了miR-144在红细胞氧化应激耐受中机制。miR-144/451不仅提供了一个治疗血液系统疾病的药物靶点，还可以作为生物标志物。miR-144/451(eGFP)等位基因，可作为分析造血前体细胞的红细胞潜能的新工具，可在细胞水平定量分析红细胞起源［13］。另外，在红细胞刺激药物(erythropoiesis-stimulating agent，CERA)注射后27 d，miR-144 在血浆中持续高表达，因此miR-144可以作为CERA滥用敏感、特异的血浆标志物［14］。

1.2 白血病

MiRs在血细胞生成的过程中是重要的转录调节因子，其表达异常与血液系统恶性肿瘤的发病密切相关。伊马替尼耐药严重影响了慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia，CML)的治疗，Liu 等［15］发现c-myc在伊马替尼耐药的K562R细胞中上调，进而提高miR-144/451的表达，而敲低c-myc或恢复miR-144/451可增加细胞对伊马替尼的敏感性，证明了cmyc和miR-144/451之间的调节通路并突出了靶向cmyc或miR-144/451对减轻伊马替尼耐药的应用价值。另有研究［16］显示模拟微重力(modeled microgravity，MMG)能够改变被辐射的人外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes，PBL)miRs表达谱，表现为降低放射敏感的miRs数量;此外，联合使用辐射和MMG 则 miR-144、miR-27a、let-7i*等 miRs表达不发生变化。研究［17］显示，miR-144等miRs在CML患者的加速期、急变期、血液病复发、治疗失败等不同阶段和状态下的表达有差异;生物信息学分析显示，其靶基因为与细胞周期和生长调节相关的蛋白比如转化生长因子β型Ⅱ受体(transforming growth factor-beta receptor type-2，TGFBR2)、母亲 DPP同源物 4(mothers against DPP homolog 4，SMAD4)、runt相关转录因子(runt-related transcription factor 1，RUNX1)。FLT3基因内部串联重复(FLT3-internal tandem duplications，FLT3-ITDs)是对60岁以上的细胞遗传学正常的急性骨髓性白血病(cytogenetically normal acute myeloid leukemia，CN-AML)一个不利诊断标志物，FLT3-ITDs相关的miRs表达特征包括miR-144和miR-451的下调［18］，FLT3-ITD鉴定年长的CN-AML患者伴有分子水平的高危险因素是与基因和miRs表达特征有关，为AML新治疗方法提供了生物学的见解。

2 癌症

MiRs在肿瘤发生、进展及转移过程中起到重要的作用［19］，miR-144参与了结肠直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、喉癌、恶性间皮瘤的发病。Wang等［20］通过meta-analysis显示肿瘤相关的 miRs，其中包括 hsamiR-144。基因芯片的筛查显示，miR-144在喉癌［21］、恶性间皮瘤(malignant mesothelioma，MM)［22］、甲状腺滤泡癌(follicular carcinoma，FC)［23］、骨肉瘤［24］中均显著下调。Gaedcke等［25］进行了57例直肠癌患者的肿瘤与正常黏膜组织的miRs芯片比较，发现了49个直肠癌特异 miRs，其中包括 miR-144。Kalimutho等［26］通过筛查结肠直肠癌(colorectal cancer，CRC)患者排泄物中648个miRs，发现miR-144*在CRC患者排泄物及直肠样本中均显著增加，且在排泄物中稳定存在，为CRC诊断预后提供了一种可定量、非侵入性的新方法。Sureban等［27］采用纳米技术将干扰片段NP-siDCAMKL-1转染到人结肠癌细胞HCT116，抑制其生长，机制包括miR-144依赖的下调Notch-1的表达。生物信息学分析显示miR-144的靶蛋白为细胞周期调节蛋白Rb1、PTEN，通过抑制Rb1和PTEN的mRNAs翻译，还可以作用于versican的3'UTR，肿瘤形成实验证明转染了versican的3'UTR的细胞肿瘤形成较小［28］。

3 神经系统疾病

MiR-144参与了神经病和精神病的病理过程［29］。miR-144在坐骨神经横断面的初级神经元中表达下调［30］，在神经卡压模型脊髓背根神经节中显著下调［31］。生物信息学分析［32］显示，miR-144 与 miR-130、miR-19、miR-101 共调解 ATXN1、RNF38、ROBO2、ZEB2、NEUROD1、BCL2L11、ERBB4，提示 hsa-miR-144可能是神经变性病相关的 miRs。Persengiev等［33］通过人、黑猩猩、恒河猴的miRs芯片分析发现miR-144在脑老化、脊髓小脑共济失调(spinocerebellar ataxia type 1，SCA1)病理过程中的作用，miR-144在SCA1和Alzheimer患者小脑和皮层中高于年龄相当的正常人。miR-144在调节 SCA1的致病基因(ataxin 1，ATXN1)表达中起主要调节作用，抑制miR-144可以提高人细胞中ATXN1的水平。Gu等［34］发现，胎儿发生神经管缺损(neural tube defects，NTDs)的孕妇血清中miR-144等6个miRs表达上调，miR-144有潜力成为诊断和预后NTDs的血浆标志物，母体血浆中胎盘miRs为非侵入性产前诊断提供了新的可能。miR-144在长期使用情绪稳定剂包括锂和丙戊酸钠后的大鼠海马中显著上调［35］。目前使用的抗精神病药物多数靶向单胺受体，miRs可以作为新的抗精神病药物的靶点，目前鉴定的最有希望的治疗精神分裂症的靶点为miR-181、miR-346和miR-195，治疗躁郁症的靶点为 miR-34a 和 miR-144［36］。

4 心血管系统疾病

近年的研究［37］表明，拮抗miRs可望纠正心衰时的不良信号转导径路，具有成为预防和治疗靶标的潜能。室间隔缺损小鼠模型——双链复合蛋白8(paired box gene 8，Pax-8)敲除小鼠心脏中miR-144表达上调。缺血前适应使心脏中miR-144/451簇表达升高，敲除miR-144/451簇减弱了前适应介导的心脏保护作用，这与靶基因Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac-1)有关［38］。另外，miR-144/451簇对心肌缺血再灌注损伤的保护作用，至少部分通过靶向CUG三聚体重复，核糖核酸结合蛋白2(CUG triplet repeat，RNA binding protein 2，CUGBP2)-COX-2通路实现的，而miR-144/451簇的表达则是由转录因子GATA-4调控的［39］。Ovcharenko等［40］证明，导入 let-7c、miR-144 等 miRs会影响Caspase级联反应的活性，预测这些内源性miRs的靶点包括编码死亡受体、Caspases和其他凋亡相关的基因。将miR-144类似物转染至大鼠H9C2心肌细胞中，细胞增生明显降低、Caspase-3活性明显升高、细胞凋亡率明显升高［41］，提示miR-144是促进心肌细胞凋亡的基因。miR-144/451为治疗缺血性心脏病、先天性心脏病提供了新的靶点。

5 其他疾病

miR-144在注射链脲酶素(streptozotocin，STZ)10周的糖尿病大鼠视网膜中显著下调［42］。Karolina等［43］证明，miR-144在2型糖尿病中通过抑制胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1，IRS-1)减弱胰岛素信号通路。miR-144在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化中显著下调［44］。miR-144*在肺结核患者的单个核细胞中显著上调，且miR-144*主要表达在T淋巴细胞中，可以抑制炎症因子肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ的产生以及 T淋巴细胞的增生，证明了 miR-144*在抗结核免疫反应中的作用［45］。另外，miR-144在小鼠肝组织部分切除后12 h下调［46］。非编码miRs在实验动物的细胞应激反应和突然的环境改变也起作用。Katsuura等［47］发现，在健康的日本医学生考试后外周血中miR-144/144*显著升高，miR-144*浓度在考试后变化的百分比与在相同时间点循环中干扰素-γ和/或 肿瘤坏死因子-α浓度变化的百分比呈显著的相关性，证明外周血中miR-144/144*是自然压力因素的潜在生物标志物。

6 小结

由于miRs以稳定的形式存在于各种体液包括血浆、尿液及粪便中，而miR-144在多种疾病中均发生显著的变化，使其可以作为多种疾病特异、敏感的生物标记物，为癌症、孕妇的产前检查等提供了一种非侵入性的诊断方法。miR-144在多种系统疾病的作用及机制中均有研究，提示其可以作为一个新的药物治疗靶点，目前研究最多的是血液系统，但其作用存在矛盾之处;而在发病率、致死率较高的癌症、心脑血管疾病中的研究较少。另外，miR-144的作用靶点及机制不明确，目前主要采用生物信息学方法对其靶点进行预测居多，部分采用体外荧光素酶报告基因法进行验证，多数研究不够系统;且体外细胞实验居多，体内实验较少，不能够说明miR-144的整体作用。随着研究的逐渐深入，miR144将成为治疗血液病、癌症、心脑血管疾病的诊断、治疗新靶点。

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