猪去氧胆酸与鹅去氧胆酸的提取纯化工艺

张 飞，赵静国，赵蒙浩

（武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北 武汉430023）

猪胆汁酸是猪胆汁的主要成分，约占猪胆汁总量的50%～70%，主要有猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、猪胆酸等，其中猪去氧胆酸约占40%、鹅去氧胆酸约占25%。猪去氧胆酸具有降血脂、镇痉、祛痰等作用，为人工牛磺的重要成分，临床上可用于治疗高血脂症、气管炎以及由肝胆疾病引起的消化不良，对百日咳菌、白喉杆菌、金黄色葡萄球菌亦有抑制作用[1］。周维善等[2］还以猪去氧胆酸为原料，合成了具有生理活性的甾体物质。鹅去氧胆酸在临床上不仅用作溶解胆固醇类结石和纠正饱和胆汁的药物，还具有显著的平喘、抗炎、镇咳和祛痰等作用。鹅去氧胆酸也是昂贵的熊去氧胆酸的合成原料，它们都是治疗胆道疾病的有效药物[3］。目前人们主要利用猪胆汁提取猪去氧胆酸或鹅去氧胆酸，猪去氧胆酸主要用大量乙酸乙酯进行提取[4］，乙酸乙酯提取物经丙酮重结晶、甲醇（乙醇）－水重结晶或直接用柱层析[1］进行纯化，这几种方法不仅溶剂消耗量大，产品纯度也低。鹅去氧胆酸的提取方法主要有钡盐沉淀法[5］、钙盐沉淀法[6］、离子交换树脂法[7］，这些提取方法产品收率低，纯度也仅90%左右。很少有工艺能同时将猪胆汁中的猪去氧胆酸与鹅去氧胆酸提取出来。

作者根据Zlegler等[8］报道，从提取胆红素后的猪胆粉中同时提取猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸，效果较好。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

猪胆粉，上海长城药业有限公司。

柱层析硅胶、薄层硅胶板，青岛海浪硅胶干燥剂厂。

除HPLC所用试剂为色谱纯外，其余试剂均为分析纯。

YRT－3型熔点仪，天津大学精密仪器厂；Mercury Plus－400型核磁共振氢谱仪，美国Varian公司；戴安P680型高效液相色谱仪[Grace Davison Discovery Sciences C18色谱柱（4.6mm×250mm），以乙腈－磷酸盐（50∶50）缓冲溶液为流动相，检测波长为210 nm］；戴安UVD170U型检测器。

1.2 方法

1.2.1 混合猪胆汁酸粗品制备

在2L圆底烧瓶中加入猪胆粉100g、10%氢氧化钠溶液1000mL，加热回流20h，皂化完全后，静置冷却至室温，出现分层，底部有胶状沉淀，虹吸抽去上层黄色液体，沉淀加少量水溶解，抽滤，滤液加入少量活性炭脱色，再次抽滤，收集滤液，加入10%稀盐酸酸化至pH值1～2，静置过滤，沉淀水洗至中性，于50℃真空干燥，得混合猪胆汁酸粗品65g，收率（以猪胆粉计）65%。

1.2.2 混合猪胆汁酸的甲酯化

在500mL圆底烧瓶中加入混合猪胆汁酸粗品50g、甲醇300mL，搅拌溶解后，加入30mL浓盐酸，回流搅拌3h，TLC监测反应完毕后，以无水NaHCO3固体调pH值至中性，过滤去除无机盐，滤饼用甲醇洗涤，合并滤液及洗液，减压回收甲醇，得棕褐色粘稠状物和白色无机盐。用乙酸乙酯提取，滤除无机盐，分别以饱和NaHCO3溶液和水洗涤，无水MgSO4干燥4h，抽滤，减压去除乙酸乙酯，得棕褐色粘稠状混合猪胆汁酸甲酯51g。

1.2.3 猪去氧胆酸的提取与纯化

向装有混合猪胆汁酸甲酯的烧瓶中加入甲苯60mL，于70℃油浴下溶解完全后停止加热，趁热倒入结晶皿中，自然冷却至室温后放入冰箱约4h，析出白色冻状物，抽滤，滤饼以少量甲苯洗涤2～3次，得到白色固体，固体再用甲苯重结晶，于50℃真空干燥，得白色固体20.1g，经薄层色谱检测为单一斑点（V乙酸乙酯∶V石油醚＝2∶1，5%磷钼酸乙醇溶液显色，Rf值为0.35），即猪去氧胆酸甲酯。

在250mL烧瓶中加入猪去氧胆酸甲酯20.1g、氢氧化钠4g、乙醇50mL和水20mL，搅拌回流反应6h，TLC（展开剂：V乙酸乙酯∶V石油醚∶V甲酸＝5∶5∶0.6，5%磷钼酸乙醇溶液显色，Rf值为0.42）监测反应完毕后，减压回收溶剂至干，得淡黄色固体，加水50mL溶解，搅拌下用10%盐酸溶液调pH值1～2，析出固体，抽滤，滤饼用水洗涤至中性，于50℃真空干燥得到白色固体粉末19.0g，纯度经HPLC检测为98.6%。收率38%。

1.2.4 鹅去氧胆酸的提取与纯化

将1.2.3项下的滤液、洗液以及重结晶母液合并，减压回收甲苯至干，得到棕色粘稠状物25g。取硅胶约300g以干法装柱，取混合猪胆汁酸甲酯10g上样，以乙酸乙酯－石油醚（体积比1∶1）洗脱，TLC（展开剂：V乙酸乙酯∶V石油醚＝2∶1，5%磷钼酸乙醇溶液显色，Rf值为0.58）监测分离进程，收集含鹅去氧胆酸甲酯的洗脱液，直至第二个点出现时停止。

将所得洗脱液减压浓缩，得到淡黄色粉末状固体4g，分别加入乙醇20mL、氢氧化钠1g和水5mL，搅拌回流反应6h，TLC（展开剂：V乙酸乙酯∶V石油醚∶V甲酸＝5∶5∶0.6，5%磷钼酸乙醇溶液显色，Rf值为0.55）监测反应完毕后，减压回收溶剂至干，得淡黄色固体，加水10mL溶解，搅拌下用10%盐酸溶液调pH值1～2，析出固体，抽滤，滤饼用水洗涤至中性，于50℃真空干燥得到淡黄色固体3.7g，纯度经HPLC检测为99.0%。收率18.5%。

2 结果与讨论

2.1 产物结构表征

（1）猪去氧胆酸：m.p.201～202℃；1HNMR（400 MHz，DMSO－d6），δ：11.95（s，1H，24－COOH），4.42（d，1H，3－OH），4.24（d，1H，6－OH），3.83（m，1H，6－CH），3.57（m，1H，3－CH），0.91（d，3H，21－CH3），0.84（s，3H，19－CH3），0.60（s，3H，18－CH3）。与文献值[1］基本一致。

（2）鹅去氧胆酸：m.p.142～143℃。1HNMR（400 MHz，CDCl3），δ：0.66（3H，s，13－CH3），0.90（3H，s，10－CH3），0.92（3H，d，20－CH3），3.48（1H，br，3－H），3.85（H，br，7－H）），与文献值[9］基本一致。

2.2 讨论

（1）先将猪胆粉皂化处理，混合猪胆汁酸粗品经甲酯化，猪去氧胆酸甲酯与甲苯形成复合物，利用该复合物不溶于甲苯的特点，即可从甲苯中分离猪去氧胆酸甲酯。虽然用苯也可形成复合物，但苯的毒性太大，而以毒性较小的甲苯代替苯，提取纯度与收率都有所提高，并且操作简单、节约溶剂，猪去氧胆酸纯度提高到98.6%，收率达到38%。

（2）利用鹅去氧胆酸甲酯二醋酸酯在有机溶剂中重结晶的方法提取鹅去氧胆酸，步骤较多，操作繁琐，产品纯度也不高[8］。若直接用层析柱分离猪混合胆汁酸[1］，由于几种胆汁酸极性偏大，且差异较小，洗脱剂很难将它们分离，而随意增加洗脱剂极性又易使原料变质。研究发现，将原料甲酯化后，分离效率明显提高。沈季铭等[10］采用石油醚－丙酮体系，丙酮易挥发、极性易改变。本研究重新探索了洗脱剂的选取，确定为乙酸乙酯－石油醚，在其体积比为1∶1时出现鹅去氧胆酸甲酯单点，分离时间短且分离效果好。

3 结论

建立了从提取胆红素后的猪胆粉中同时提取猪去氧胆酸与鹅去氧胆酸的方法。利用猪去氧胆酸甲酯与甲苯形成的复合物不溶于甲苯的性质将其分离出来，利用柱层析分离得到鹅去氧胆酸甲酯；然后分别经碱水解得到高纯度的猪去氧胆酸与鹅去氧胆酸，纯度显著提高。此工艺步骤少、操作简单、原料利用充分，适合于工业化生产。

[1]苏红，叶利民，杨轶浠，等.猪去氧胆酸的纯化工艺[J］.华西药学杂志，2006，21（4）：360－362.

[2]周维善，王锺麒.从猪去氧胆酸合成具有生物活性的甾体化合物[J］.中国医药工业杂志，1991，22（1）：30－36.

[3]潘现军，张晓梅.从猪胆膏中分离纯化鹅去氧胆酸的新工艺[J］.河北医药，2006，28（2）：147－148.

[4]陆进，杜守颖，赵丽瑞，等.猪去氧胆酸提取工艺研究[J］.中国中药杂志，2004，29（5）：414－417.

[5]罗小明，吴四维，王星敏.猪胆汁中鹅去氧胆酸的提取[J］.重庆广播电视大学学报，1999，（4）：48.

[6]曹荣安，李良玉，张丽萍.猪胆汁中鹅去氧胆酸提取工艺的研究[J］.食品研究与开发，2011，32（4）：12－15.

[7]杨春梅，王洪钟，胡瑞兰，等.几种动物胆汁的组分对比及树脂法精制CDCA初探[J］.新疆农业科学，2006，43（6）：467－471.

[8]Zlegler P，Attwell M C，Masslah T F，et al.Chenodeoxycholic acid[P］.CA 1 041 479，1978－10－31.

[9]刘雁红，胡祥正.鸭胆膏中鹅去氧胆酸的提取工艺[J］.天津科技大学学报，2009，24（3）：43－45.

[10]沈季铭，周维善.猪胆汁中胆烷酸的分离和鉴定[J］.医药工业，1988，（12）：529－531.