分子辅助筛选特异茶树种质资源的研究进展

李 慧，崔清梅，张 强，梁金波

(恩施州农业科学院，湖北 恩施445000)

种质资源是植物进行品种创新和研究利用的基础，也是对珍稀资源、特异资源保护的基础．中国是世界茶树的起源中心［1］，在世界生产茶叶的国家中，中国的茶园面积最为广大，种质资源最为丰富． 为了更好的发现和保护利用这些茶树种质资源，我国已建成世界上遗传多样性最丰富的国家种质杭州茶树圃，并将进行鉴定评价所取得的数据录入“国家农作物种质资源圃信息系统”［2］．但是，随着茶树无性系良种繁殖的大力推广，以及城市化建设等现代化事业的进行，许多种质资源特别是特异的种质资源正在大幅度减少，甚至即将消失，我国茶树种质资源面临着严重的问题．于是，对我国特异的茶树种质资源进行有目的收集，并从根本上弄清其特异性，从而有针对性而高效的对其进行保护和利用，成为了目前亟待解决的问题．对此，各地的茶树研究者非常重视特异茶树种质资源的筛选与利用［3－4］．先后选育出安吉白茶、黄金芽、红碎茶［5］、高EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)含量［6］、不含咖啡碱［7］、高咖啡碱、抗寒［8］等具有特异性的茶树种质资源．

传统的茶树种质资源筛选及鉴定工作主要依赖于形态学的调查和生理生化成分分析而进行，缺乏客观性，且存在周期长，易受环境因素影响，等．近年来，随着分子技术的快速发展，各种分子标记技术和辅助手段越来越多的应用在筛选特异的茶树种质资源上，并得到了一系列化学成分、外观品质、逆境和抗虫等相关的特异茶树种质资源．本文论述了国内外运用分子手段辅助筛选这些特异的茶树种质资源的研究进展，以期为进一步研究和发掘茶树良种提供依据，为更好的保护利用茶树种质资源打下基础．

1 低咖啡碱、高儿茶素茶树种质资源

茶叶中含有茶多酚、咖啡碱、维生素、茶叶皂苷和茶氨酸等多种有效成分，具有抗菌、抗氧化、防癌、降低胆固醇等功能．其中咖啡碱含量一般为鲜叶干重的2%～4%，对茶汤滋味的形成有重要作用．但是由于容易引起心悸、失眠、焦虑等不良反应，常常给神经衰弱者、心血管疾病患者和孕妇等特殊人群造成困扰，而大大减少了此类消费群体［9］．为此，研究者开始研究和寻找具有低咖啡碱含量的茶树种质资源，试图寻找与咖啡碱相关的基因．文海涛以南昆山毛叶茶的春季嫩稍为材料，筛选出了低咖啡碱含量的单株，然后通过构建南昆山毛叶茶的cDNA 文库和运用同源探针杂交筛选的方法克隆并获得了咖啡碱合成过程中的两个关键酶:NMT5(N－甲基转移酶)和NMT7．在对这两个基因进一步的表达分析中还发现，无论是南昆山毛叶茶还是英红九号，这两个茶树品种中的NMT 基因表达都是春茶高于秋季，芽头＞第一叶＞第二叶＞第三叶，这说明，春茶中的芽茶是低咖啡碱茶叶的最佳来源［10］． 张广辉［11］则通过表达茶树TCS(咖啡因合成酶)基因的发夹RNA(hpRNA)，利用RNAi 诱导的基因沉默的系统传递性来抑制茶树叶片和芽中TCS 基因的表达，进而抑制咖啡因的生物合成，降低其含量，从而为今后获得低咖啡因茶树育种材料做基础．

茶多酚也是茶树中主要的次生代谢产物之一，其含量可达鲜叶干重的18%～36%，具有抗氧化和清除自由基、抗辐射和抵御紫外线的功能，对茶叶的色、香、味品质的形成有重要作用［12］．其中儿茶素占茶多酚总量的70%～80%，而属于酯型儿茶素的EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)是绿茶的主要活性成分和茶叶具有抗癌功效的核心成分［6］．Singh 等［13－14］先后从茶叶中克隆出C4H、ANS、CHS、DFR、F3H、4CL、CHI、F3’5’H、LCR、ANR 等调控儿茶素苯丙烷合成途径的基因．杨冬青［15］则通过建立两株生长形态和儿茶素含量均不同的愈伤组织差异表达的cDNA－AFLP 文库，得到了与茶树儿茶素相关的主要预测基因:咖啡酸O－转甲基酶基因、苯丙氨酸解氨酶基因、UDPG:花青素3’－O 型葡萄糖基转移酶、CsMYBl 转录因子基因、CsMYB2转录因子基因、CsWD40 重复蛋白和2，4－D 可诱导的谷胱甘肽－S－转移酶基因，并发现随着鲜叶成熟度的变化，这些基因的表达规律并不相同．

2 叶色变异的茶树种质资源

茶树的芽叶颜色是决定茶叶的加工工艺以及影响茶叶品质的主要因素之一，因此，筛选在颜色上具有特异性的茶树资源也是目前研究的热点之一．

众所周知，MYB 蛋白是植物中重要的转录因子之一，广泛参与植物的逆境胁迫、细胞分化、叶片形态形成以及次生代谢调控等生物过程．而R2R3－MYB 型是MYB 蛋白中最大的一类转录因子，主要参与植物花青苷的代谢调节［16－17］．在对茶树特异资源“龙井紫芽”遮阴处理后，比较新生芽叶中花青素含量及R2R3－MYB型转录因子基因的表达变化发现，遮阴处理能降低茶树新梢中的花青素含量并改变芽叶颜色，同时CsMYB1的表达也出现明显的增加，说明CsMYB1 的表达可能与茶树花青素含量变化有一定的相关性．该研究还分离克隆出另一个转录因子WD40，但是它是否通过某种方式共同调控茶树花青素的代谢还有待进一步的研究［18］．另外还有研究发现，茶树资源产生特异叶色的原因，除了是呈色物质叶绿素、花青素含量以及比例发生了变化外，可能还与植物的叶绿素代谢有关．陈林波等在特异茶树品种“紫娟”中筛选到的差异表达基因中也包含了多个与叶绿素代谢相关的基因，如NADPH－原叶绿素酸酯氧化还原酶(POR)、叶绿素A/B 结合蛋白、Mg－原卟啉Ⅸ单甲基酯环化酶等，其中POR 在幼嫩叶片中上调表达．该研究还获得1 个与肉桂酰辅酶A 还原酶同源的基因片段，该基因在成熟叶片中上调表达．因此，推测可能是肉桂酰辅酶A 还原酶跟查尔酮合成酶竞争相同的底物香豆酰辅酶A，而使成熟叶片中类黄酮代谢受到抑制，导致花青素的合成减少．另外在幼嫩叶片还获得1 个与细胞色素P450 蛋白同源的片段，该蛋白在植物类黄酮代谢途径中起着至关重要的作用，能催化羟基化、脱烷基、环化以及转移作用．这些可能是幼嫩叶片比成熟叶片紫的另一个原因［19］．这些分子片段都为进一步利用及创造叶色变异的茶树种质资源提供了方向及基础．

3 耐旱抗寒等抗逆境的茶树种质资源

各种逆境条件是植物在生长发育过程中经常会遇到的情况，面对逆境，植物自身的保护机制会发生一系列的生理代谢反应和特殊生化过程，使代谢和生长发育受到可逆性的抑制，但是情况严重时会引起不可逆的伤害，导致植株直接死亡．对于茶树这种经济作物来说，干旱、盐渍、低温等胁迫因素成为严重限制茶树分布区域并影响茶叶产量的重要因素之一．因此，筛选能抵抗不同逆境的茶树种质资源也成为研究热点．

研究者发现，色素不仅在维持叶色、花色方面起重要作用，作为一种次生代谢产物，有些色素还在植物的抗逆性中起作用．有的研究发现，随着茶树种质资源的水分胁迫程度的加重，花青素含量呈逐渐增加的趋势，并且与之合成相关的苯丙氨酸裂解酶(PAL)活性也呈上升趋势［20］，但在Kashmir Singh 等［21］对茶叶的实验中却发现，花青素还原酶(CsANR)的表达在干早胁迫下呈下调表达．类似的，在陈盛相等［22］的实验中，与色素较接近的基因片段N3－5 也是随着干旱胁迫时间的延长表达量却逐渐降低．

产生结果不一致的主要原因可能是由于植物抗性机理并不是单个基因表达所能完成的，而是多个基因协调表达的结果［23］．因此，同一个基因可能调控不同的逆境条件．比如在对获得的茶树多元醇转运子基因片段CsPLt 进行分析时，发现该基因可受低温、高盐以及脱水等多种胁迫诱导，推测其在响应非生物胁迫中发挥重要作用［24］．类似的，茶树的ERF 基因能被低温、乙烯、脱水、高盐等非生物胁迫诱导表达，特别是对低温、乙烯处理响应较为强烈．推测该基因在茶树抗逆生理中，尤其是在抗寒分子机制中有着重要功能［25］．再有，在对耐旱品种UPASI－9 和干旱敏感品种TV2 进行分析后，研究者识别出了分别与细胞防御、细胞运输和新陈代谢等有关的基因共49 个．进一步运用qPCR 技术进行检测后，发现奇异果甜蛋白样蛋白(CsTLP)、几丁质酶(CsCHT)和胚胎晚期丰富蛋白3(CsLEA3)是使植物更加耐旱并从干旱胁迫中恢复的关键基因［26］．

再如，利用DDRT－PCR 对不同抗寒性的茶树进行研究时，与茶树抗寒性有关的差异表达基因分别与具有单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)和碳酸酐酶(CA)功能的nectarinⅢ、甘油磷酰胆碱双酯酶磷酸二酯酶(GPX－PDE)家族蛋白、参与脂质代谢主要酶之一的卵磷脂胆固醇酰基转移酶蛋白(LCAT)家族、调节微管蛋白结构的微管蛋白C 伴侣基因具有一定同源性，说明茶树的抗寒性与这些蛋白具有一定的关系［27］．与茶树冷响应相关的基因还有CsICE1 和CsCBF1，且CsCBF1 在正常温度(20℃)下并不表达，只有在较低的温度(4℃)下才表达，这两个基因的表达在茶树中是保守的［28］．房婉萍等［29］则克隆了与冷胁迫有关的茶树CsHl基因的全长DNA 序列，该基因含有2 个外显子和1 个内含子，其内含子中存在TATA 的真核生物启动子元件以及ABRE 等逆境激素应答元件，推测CsHl 基因内含子可能具有增强该基因转录及逆境应答的作用．

还有的研究发现，抗坏血酸过氧化物酶(APX)转基因的正义表达也可以提高转基因植物的抗性． 在对不同茶树品种萎凋过程中APX 基因的表达发现，APX 基因的表达量随着萎凋时间的延长呈现出“升高一降低—再升高一再降低”的变化特点．而且，随着萎凋时间的延长(18 h)，细胞中H2O2含量的增加，APX 基因的表达量也迅速增加;随着萎凋时间的进一步延长(24、36 h)，APX 基因的表达量显著下降［30］．

除了干旱和寒冷，光破坏也是植物的逆境之一．韦朝领等［31］克隆了光保护中的关键酶紫黄素脱环氧化酶(VDE)的全长cDNA，长度为1 632 bp．并发现其具有热稳定性，为从分子生物学角度研究和调控茶树的叶黄素循环功能，进而提高其抗逆性奠定基础［31］．由于植物对逆境的响应是多方面、多途径协调完成的，所以，要确切的了解茶树在逆境时的具体调控途径还需要进行进一步的克隆及功能分析．

4 抗虫害的茶树种质资源

茶树虫害是影响茶叶产量和品质的主要原因之一，随着我国各地茶树虫害的泛滥以及对农药和杀虫剂的限制，近年来，从分子层面研究茶树的抗虫性成为研究者们的热点之一．在韦朝领［31］的研究中，发现如果茶树被茶尺蠖的取食诱导后，构成光合生物内周天线的重要的色素蛋白复合物植物光系统ⅡCP43 蛋白基因会上调表达，分析这是茶树在受虫害后，为了增加对虫害的生态适应性而进行的光合补偿机制．同样地，在该研究中，发现A45 编码的蛋白和β－木糖苷酶同一性很高．而β－木糖苷酶可以参与分步水解β－樱草糖苷生成挥发性苷元，从而对茶树叶部病害产生抗性［32］．而且这些挥发性苷元同时也是茶园茶树－害虫－天敌间的化学通讯物质，因为糖苷类香气前体常常能够引诱天敌昆虫，从而导致茶树对害虫产生间接抗性．

在该研究获得的20 个差异片段中，有2 个差异片段(A51 和M13)属于未知功能蛋白．此外，有11 个差异片段没有发现比对序列，可能是由于茶树上对害虫取食诱导的分子机制研究较少，也可能是所获取的差异序列片段偏短，序列提供的信息相对较少，也可能是茶树被茶尺蠖取食诱导所产生的独特差异基因，还待进一步克隆和确认［33］．但是这些研究也提供了从分子方面增加茶树抗虫性的可能．

5 展望

特异的茶树种质资源不仅是人们保护的对象，更是进行种质创新和品种选育的基础．但随着人口压力、毁林开荒和经济建设等方面的原因，茶树种质资源仍在不断丧失．再者，由于茶叶的经济效益，人们有意识地进行良种选育，并进行大幅度地无性繁殖，在提高产量、满足人们各种需求的同时，使得种质资源的遗传多样性的降低，对逆境的遗传脆弱性升高［34－35］．使茶树种质资源向着单一化方向发展的趋势，长久下去，不利于茶树的种质创新和品种选育．过去，由于技术上的限制，人们只能从主观意识强、缺乏统一规范的外观性状以及单纯的检测生化成分这些方法来了解并筛选茶树种质资源．近年来，随着蛋白质技术、分子技术的快速发展和更新，人们越来越多的尝试从更根本、更确切的原因上寻找合适的茶树种质资源．为此，为了筛选出适合不同人群和需求的茶树种质资源，茶树研究者进行了大量的研究和试验，但是，目前对茶树种质资源的分子研究还处于起步阶段，仍需作大量的工作，包括基因功能鉴定、基因分离和克隆、载体的构建、目的基因转化技术、转基因植株的鉴定等．但是相信随着茶树分子研究的深入，分子技术会为特异茶树资源以及抗病虫育种提供广阔的应用前景，为实现茶叶生产的高产、优质、无污染打好基础．

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