分泌吲哚乙酸洽草内生细菌的筛选及其对种子发芽的影响

王辰月　陈秀蓉　杨成德

摘要：从分离的31株洽草内生细菌中筛选出3株具有较强的IAA分泌功能的内生细菌QS3，QG3和QS15，用其稀释过的培养液对苜蓿、红三叶、燕麦、黑麦草浸种，测定了供试牧草种子的发芽势、发芽率、胚根长度等指标，发现种子的发芽势及发芽率平均提高了5%～15%，胚根长度较对照也均增加，且差异显著（P<0.05）。

关键词：内生细菌；分泌吲哚乙酸；发芽

中图分类号：Q 936 文献标识码：A 文章编号：10095500（2013）01002104

目前，植物内生细菌对植物生长的促进作用主要分为两方面：一方面，植物内生细菌可通过产生植物生长物质（植物生长素、赤霉素、细胞激动素等）促进植物生长；另一方面，植物内生细菌也可通过自身的固氮、溶磷以及对不同植物病原菌的拮抗作用或者通过增强植物对矿物质利用的有效性间接的促进植物生长＼[1-5＼]。研究结果显示，内生细菌在增加植株株高、干重、提高根茎重量以及增强植株生长势等方面均有明显的促进作用。有研究者分别从油菜的根和茎中进行了内生细菌的分离工作，并用其中7株分离物的菌悬液处理油菜和番茄的种子，发现供试菌株能不同程度地提高油菜和番茄种子的萌发速度、增加幼苗的长度＼[6＼]。何红等＼[7＼]在研究BS1和BS2菌株对辣椒和白菜的促生作用机制时发现，用菌株培养液浸种后，可使植株体内生长素（IAA）、赤霉素（GA3）等植物内源激素含量增加，脱落酸（ABA）含量减少。因此，筛选具有IAA分泌能力的植物内生细菌，为开发利用高寒草地植物内生细菌资源，以及进一步研发生物菌肥等提供了理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 供试31株内生细菌均分离自东祁连山高寒草地优势禾本科洽草（Koeleria cristata）。

1.1.2 仪器及试剂 台式高速冷冻离心机、S2000型分光光度计、IOC402.XXI.C型控温振荡器、各种微量移液器（Biometra公司）。

PC比色液：称取12 g FeCl3溶于300 mL蒸馏水，缓慢加入429.7 mL 98%的H2SO4，冷却后将溶液定容至1 L，该比色液测定值为0.3～20 μg/mL。

S2比色液：称取4.5 g FeCl3溶于300 mL蒸馏水，缓慢加入587.4 mL 98% 的H2SO4，冷却后将溶液定容至1 L，该比色液测定值为5～200 μg/mL，超过100 μg/mL时就应稀释。

1.1.3 培养基 TSA培养基用于洽草内生细菌的分离；牛肉膏蛋白胨培养基用于菌种的纯化和保存；King氏培养基用于分泌IAA内生细菌的筛选及定量测定。

1.2 实验方法

1.2.1 洽草内生细菌的分离 先将植物样品用清水洗净，去除植物体表面的土壤及杂质，后将多余水分风干，称取植物样品2 g，采用高寒草地牧草内生细菌分离的优化方法进行植物样品表面的消毒和内生细菌的分离＼[8＼]。植物样品表面消毒后，在无菌条件下将植物样品研碎，吸取200 μL植物组织液，涂布于TSA培养基上，置于28 ℃下培养数日，待菌落长出后，纯化分离的菌种并保存。

1.2.2 分泌IAA内生细菌的初步筛选 将从洽草内分离出的内生细菌菌株采用Salkowski比色法进行初步筛选＼[9＼]，然后，对筛选出的具有IAA分泌能力的菌种进行定量测定。

1.2.3 分泌IAA内生细菌的定量测定 采用分析纯3IAA配制两组标准溶液，第1组标准溶液浓度（mg/L）依次为2.5，5.0，7.5，10.0，12.5，15.0，17.5；第2组标准溶液浓度（mg/L）依次为25，50，75，100，125，150，175 mg/L。吸取2 mL第1组标准液，加入等量的PC比色液；吸取2 mL第2组标准液，加入等量的S2比色液，都于室温下黑暗处静置30 min，然后立即用分光光度计测定D530 nm值，每浓度梯度3个重复，记录数据。以标准溶液浓度为横坐标，每浓度梯度对应的D530 nm值为纵坐标，分别绘制PC比色液及S2比色液的标准曲线。

1.2.4 菌株分泌IAA能力的定量测定 将筛选出的具有IAA分泌能力的菌株活化培养后接种到King氏培养基中，获得其培养液，培养液离心（10 000 r/min）10 min，吸取适量上清液加入等量比色液，室温下避光静置30 min，立即用分光光度计测定相应的D530 nm值，记录数据，选用相应的标准曲线计算出待测菌株所分泌的IAA的量，根据PC比色液和S2比色液所测定的浓度范围确定待测菌株分泌IAA的量。

1.2.5 分泌IAA内生细菌对植物种子发芽的影响 供试草种选用苜蓿、红三叶、黑麦草和燕麦，测定供试植物种子的千粒质量。将筛选出的3株具有较好IAA分泌能力的内生细菌活化后接种在牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28 ℃，120 r/min摇床培养2 d，将培养液以1∶50的比例稀释，用稀释好的培养液浸泡供试植物种子12 h，将处理后的种子用纸上发芽法置于室温下培养数日，每处理3个重复，每发芽床50粒种子，分别统计并测定不同种子的发芽势、发芽率＼[10＼]及胚根长度。

2 结果与分析

2.1 洽草内生细菌的分离

实验从洽草共分离出内生细菌31株，其中，根内11株，茎和叶内共分离出20株。

2.2 分泌IAA内生细菌的初步筛选

用Salkowski比色法初步筛选后，共得到5株具有IAA分泌能力的内生细菌。

2.3 分泌IAA内生细菌的定量测定

2.3.1 比色标准曲线（图1）

2.3.2 菌株分泌IAA的定量测定 根据细菌在产生IAA过程中是否有色氨酸作为前体物质，把细菌产生IAA的途径分为色氨酸途径和非色氨酸途径。实验结果表明（表1），供试菌株中QS3、QG3、QS15和XB3都为非色氨酸途径，只有菌株QA1为色氨酸途径。且供试菌株分泌IAA的能力较弱，浓度都低于20 mg/L。

2.4 分泌IAA内生细菌对植物种子发芽的影响

从种子千粒质量测定结果可以看出，供试种子品质较好，种粒较饱满，种子的品质不应作为影响发芽实验的主要因素。

实验结果表明，供试植物种子用适当浓度的菌液浸种后，与对照相比，发芽势、发芽率均有不同程度的提高，发芽种子的胚根长度有所增长。且不同菌株间对供试植物种子的促生作用也有所差异，菌株QS3与QG3的促生作用与菌株QS15相比，差异显著（P<0.05），但并未发现供试菌株培养液对植物种子发芽的影响有明显的专一性，虽然豆科种子苜蓿、红三叶，禾本科种子燕麦、黑麦草的生长特性均有所优化。

3 讨论

3.1 洽草内生细菌的分离

植物样品表面消毒效果的优劣直接影响了所分离内生细菌种类及数量的多少，消毒时间过短，消毒不够彻底，会导致植物体表面的微生物无法彻底除去；消毒时间过长，会将植物体内的部分内生菌杀死，分离得到的内生菌数量和种类减少，造成对内生细菌多样性的错误统计，同时，在后期筛选过程中，供试菌种数量减少。正确选择消毒剂并确定合适的消毒时间可以分离得到种类较为丰富的内生细菌。目前，常用的消毒剂为酒精、NaClO、升汞、SDS等，且消毒剂浓度的选择也有所不同＼[8，11＼]。潘羡心等＼[12＼]分离香蕉内生细菌时，香蕉叶片和叶鞘采用了两步消毒法，香蕉根则采用了三步消毒法，选用的消毒剂为乙醇和次氯酸钠，并且所用乙醇和次氯酸钠浓度分别为70%和3.25%，共获得30株内生细菌。

3.2 分泌IAA内生细菌的筛选

实验中筛选到具有IAA分泌能力的内生细菌产IAA能力均较弱，IAA分泌量都小于20 mg/L。筛选出的内生细菌对供试牧草种子的发芽均有一定促生作用，说明在菌株分泌低浓度IAA条件下，对植物种子的发芽有促生作用，但差异不显著。实验中未发现促生作用具有专一性，即对供试的豆科植物种子及禾本科植物种子的发芽均有一定促进作用。刘琳等＼[13＼]从春兰根组织中共分离出256株内生细菌，其中，57株具有分泌IAA的能力，且产量高于50 μg/ mL的内生细菌为9株（15.8%），产量介于20～50 μg/mL的内生细菌为14株（24.6%），其余34株（59.7%）产量低于20 μg/mL。吴瑛等＼[14＼]研究燕麦根际固氮菌分泌IAA的动态变化时，筛选出4株具有IAA分泌能力的菌株，且测定其分泌IAA能力分别为29.1、25.2、25.5、36.1 μg/mL。此次实验中筛选出的分泌IAA的内生细菌与其相比，分泌量较少。

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