杂合抗菌肽MgJ 基因真核表达载体的构建

尹 佳

（吉林化工学院环境与生物工程学院，吉林 吉林 132022）

抗菌肽（antimicrobial peptides）是具有抗菌活性的一类肽的总称。通常由13～50个氨基酸组成，为阳离子型多肽[1]。两性α-螺旋结构和两性β-折叠结构是抗菌肽最显著的结构特征。抗菌肽对细菌具有很强的杀伤作用，不宜在原核系统中直接表达，一般采用融合表达或在酵母中表达[2-3]。

本研究通过对抗菌肽Magainin-Ⅱ和JaponicinⅡ两个基因（简称M和J）的一级结构和二级结构的分析，用一段编码ser-ser-gly-ser-gly-ser的柔性连接肽序列将M基因和J基因相连，以利于M和J基因各自的空间折叠。选用巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）偏爱的密码子，通过重叠区基因扩增法（SOE法）[4]人工合成MgJ基因，然后将其连接至在巴斯德毕赤酵母中高效表达的表达载体pPICZα A上。其设计目的是获得比MagaininⅡ和JaponicinⅡ生物活性更高的抗菌肽，为杂合抗菌肽MgJ的高效分泌表达奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、质粒pPICZα A 均由本实验室保存，内切酶、dNTP、T4连接酶、DNA marker、PCR 扩增试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自TaKaRa宝生物工程有限公司。引物由联星生物合成，其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 基因的合成

引物设计：根据GenBank中的基因序列，在M基因和J基因中间用铰链ser-ser-gly-se r-gly-ser连接，按照毕赤酵母偏爱密码子表[5]设计合成8个引物，其中Up1含有EcoRⅠ酶切位点，Down2含有XbaⅠ酶切位点。各引物序列见表1。

表1 合成MgJ基因的引物序列Table 1 MgJ primers sequencs

各引物与模板之间的互补关系见图1。

图1 各引物与模板之间的互补关系示意图Fig.1 Complementation of primers

MgJ基因的合成：M1+M2（J1+J2）：94℃、5min；94℃、30s，60℃、30s，72℃、30s，每一个循环增加0.2℃，共35个循环；72℃、10min。经电泳检测后割胶回收DNA片段，并命名为M基因。相同条件下J1和J2合成J基因。

Up1-M-Down1（Up2-J-Down2）：94℃预变性5min；94℃变性30s、56℃退火30 s、72℃延伸30s；每一个循环增加0.1℃，共30个循环；72℃延伸10min。

全长片段：Up1-M-Down1、Up2-J-Down2互为引物，94℃预变性5min；94℃变性30s、56℃退 火30s、72℃延伸30s；每一个循环增加0.1℃，共30个循环；72℃延伸10min。

以上各PCR体系均为100mL。

1.2.2 目的基因的鉴定目的基因经PCR扩增后，取5μLPCR产物与DNA marker 2.0%琼脂糖凝胶电泳。

1.2.3 表达载体的构建目的基因表达载体的构建策略见图2。

图2 重组质粒pPICZαA-MgJ构建策略Fig.2 Construction of recombinant pPICZα A-MgJ

1.2.4 酶切和连接

目的基因全片段和pPICZα A均用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切，胶回收后，16℃连接过夜。

1.2.5 感受态细胞DH5α的制备和转化

按常规方法操作[6-8]。

1.2.6 阳性克隆的筛选

Zeocin筛选法[9]。

1.2.7 重组质粒的鉴定及DNA序列分析

挑取重组菌培养，提取质粒[10]，用EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切初步鉴定重组子。DNA序列分析由上海生工生物工程公司完成。

2 结果与分析

2.1 MgJ基因的合成

各引物片断拼接采用重叠PCR扩增出完整的基因。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，大小与预计的163bp相符。结果见图3、图4。

图3 目的基因的2%琼脂糖凝胶电泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of genes

图4 MgJ的2%琼脂糖凝胶电泳Fig.4 Agarose gel electrophoresis ofMgJ

2.2 阳性克隆的筛选结果

目的基因PCR扩增产物回收后与pPICZα A载体连接转化至EcoDH5α中，由于EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切线性化的pPICZα A不可能自身环化[11-12]，因此Zeocin 抗性菌落应含有所需要的重组质粒pPICZα A-MgJ。

2.3 重组质粒的鉴定及测序

将获得的重组质粒pPICZα A-MgJ用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切，经琼脂糖凝胶电泳检测，在相应位置出现条带，表明pPICZα A-MgJ构建成功，结果见图5。测序表明，基因序列与预期相符。

图5 pPICZα A-MgJ双酶切的琼脂糖凝胶电泳Fig.5 Agarose gel electrophoresis of pPICZα A-MgJ digestion

3 结论

抗菌肽必须具备两亲结构和正电荷，较多的正电荷与稳定的两性α-螺旋结合，有助于提高杀菌活性。因此，可利用这一原则来设计新型的杂合抗菌肽[13]。本研究在MagaininⅡ和JaponicinⅡ之间用一段ser-ser-gly-ser-gly-ser的柔性连接肽序列将2个基因相连，以利于增强两段序列的连接，而且还可防止连接的过程中两条序列单独表达互补配对形成二聚体。为了获得抗菌肽MgJ的全长基因片段，本研究采用了重叠区扩增基因拼接法，用互有一段互补序列的8个引物，通过PCR扩增得到了具有EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切位点的全长基因。

本研究以pPICZα A作为表达载体。因为pPICZα A即可以在原核细胞中表达，也可在真核细胞中表达，同时其表达盒的N端带有引导分泌的α交配因子（α-MF）信号序列，表达产物可以分泌到细胞外的培养基中[14-15]。由于酵母本身分泌到培养基中的蛋白很少，因此表达上清中的杂质蛋白含量很低，为进一步纯化表达蛋白提供了极大的方便。

研究结果表明，成功地构建了抗菌肽MgJ基因穿梭表达载体pPICZα A-MgJ，为杂合抗菌肽MgJ的高效分泌表达奠定了基础。

[1]刘立伟，邓 磊.抗菌肽作用机制的研究进展[J].河北化工，2012，35（7）：13-15.

[2]RAMANATHAN B,DAVIS EG,ROSS CR,et al.Cathelicidins:microbicidal activity,mechanisms of action,and roles in innate immunity[J].Microbes Infect，2002，4（3）：361-372.

[3]胡功铃，陈国平，胡宗利，等.杂合抗菌肽HMCM 的原核表达及其活性鉴定[J].药物生物技术，2012，19（1）：6-10.

[4]韩晋辉，施用晖，吕文平，等.多重PCR 合成天蚕素基因及其在E.Coli中的克隆[J].食品与生物技术学报，2006，25（4）：109-112.

[5]赵 翔，霍克克，李育阳.毕赤酵母的密码子用法分析[J].生物工程学报，2000，16（3）：308-31.

[6]明双喜，刘 艳，王沂蒙，等.抗菌肽PMAP37 基因RT-PCR 扩增、序列分析及重组原核表达载体构建[J].中国酿造，2008，26（12）：33-35.

[7]乔红伟，韩俊友，赵瑞利，等.中国林蛙抗菌肽基因在毕赤酵母中的表达及其活性检测[J].中国兽医学报，2008，28（6）：663-666.

[8]李桂平，陈仪本.一种新融合抗菌肽Hex-Mag 基因的克隆、表达及其抗菌活性的研究[J].微生物学报，2007，41（1）：115-120.

[9]赵岩岩，崔敬爱，李 帅，等.抗菌肽Cryptonin 基因真核表达载体的构建[J].农业机械.2012，21（7）：145-148.

[10]张素芳，曹瑞兵，贾 赟，等.杂合抗菌肽CecA_mil 的改造及在毕赤酵母中的分泌表达[J].微生物学报，2005，45（2）：215-219.

[11]GHOSALKAR A,SAHAI V,SRIVASTAVA A.Optimization of chemically defined medium for recombinanantPichia pastorisfor biomass production[J].Bioresource Technol，2008，99（16）：7906-7910.

[12]RAJESH T,ANTHONY T,SARANYA S,et al.Functional characterization of a new holin-like antibacterial protein coding genetmp1from goat skin surface metagenome[J].Appl Microbiol Biot，2011，89（4）：1061-1073.

[13]周磊磊.促血管生成素-2 在毕赤酵母中的分泌表达及功能研究[D].北京：中国人民解放军军事医学科学院硕士论文，2008.

[14]苏 琦，孙 燕，李 治.抗菌肽对细菌胞内杀伤作用的分子机制[J].中国生物制品学杂志，2010，23（3）：325-329.

[15]齐长学.牛乳溶菌酶在毕赤酵母中的分泌表达及活性分析[D].大庆：黑龙江八一农垦大学硕士论文，2010.