响应面优化超声辅助提取昆仑雪菊原花青素的工艺研究

贺 翠，王燕芳，马 超，谢 利，鲁小静，吴 瑛*

（1.塔里木大学 生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300；2.新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护与利用重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

昆仑雪菊（Kunlun chrysanthemum）为菊科（Asteraceae）金鸡菊属（CoreopsisLinn）多年生草本植物两色金鸡菊（C.tinctoria），其维语名称为古里恰依（Gulqai），生长在新疆和田海拔3200m～5000m以上的高寒山区环境中生草本植物[1]。昆仑雪菊被新疆维吾尔医院作为一种维药材应用，具有清热毒、胃健脾之功，当地居民把昆仑雪菊当花茶饮用[2]，昆仑雪菊可药食两用，有较大的市场前景。

原花青素[3-6]是昆仑雪菊中的次生代谢产物，具有极强的稳定性和抗氧化能力，能够抑制血小板凝聚及脂质过氧化，提高人体免疫力和防御紫外线辐射[7-8]。原花青素可开发为用于防治心脑血管疾病的药物，近年来成为某些疾病抑制的研究热点[9]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

昆仑雪菊（样品由新疆和田阳光沙漠玫瑰有限公司提供，阴干，粉碎，过60目筛。

1.2 仪器与设备

S54紫外分光光度计：上海棱光有限公司；SY-500超声波萃取仪：上海宁商超声仪器有限公司；CP224C 电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司。

原花青素标准品购于天津晶纯实业有限公司，硫酸铁铵，甲醇，正丁醇，浓盐酸等试剂为国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 原花青素标准曲线的绘制

采用铁盐催化比色法[10-11]。准确称取原花青素标准品25mg，用甲醇溶解置于100mL容量瓶中定容。准确吸取原花青素标准品溶液0.1mL、0.3mL、0.5mL、0.7mL、0.9mL、1.1mL、1.2mL定容至10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度。分别准确移取1.0mL以上溶液于10mL具塞试管中，加入9.0mL比为83∶6∶1的正丁醇∶浓盐酸∶10%硫酸铁铵反应混合液，混匀，置于沸水浴中加热40min后，立即取出冰浴冷却4min，取出后恢复至室温，同样处理的甲醇为空白调零，在测定A550nm。

1.3.2 原花青素的含量测定

精密称取昆仑雪菊粉末1.000g于6个50mL圆底烧瓶中，分别加入萃取液在不同条件下提取。每次提取液过滤3次，将滤液合并，定容于50mL容量瓶中，再从其中取出1mL于10mL具塞试管中，测定提取液中原花青素的含量。提取率计算公式：

式中：C 为浓度，mg/mL；V 为体积，mL；D 为稀释倍数；m 为样品质量，g。

1.3.3 单因素试验[8]

精密称取昆仑雪菊粉末1g于6个50mL圆底烧瓶中，分别加入萃取液在不同条件下提取。每次提取液过滤3次，将滤液合并，浓缩后定容于50mL容量瓶中，测定提取液中原花青素的含量。分别考察乙醇体积分数、超声功率、料液比、盐酸用量等因素对昆仑雪菊原花青素提取率的影响。

1.3.4 Box-Behnken试验[13-14]

运用Design-Expert软件，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，在单因素试验的基础上，采用4因素3水平的旋转组合设计[15]确定最佳提取工艺，因子水平及编码见表1。

表1 响应面分析因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

2 结果与分析

2.1 原花青素标准曲线制作

图1 原花青素标准曲线Fig.1 Standard curve of proanthocyanidins

以A550nm为纵坐标，原花青素质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得出回归方程：y=1.784x+0.0094，r=0.9994，原花青素标准品溶液在0～1.2mg/mL有良好的线性关系。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 乙醇体积分数对原花青素提取率的影响

图2 乙醇体积分数对原花青素提取率影响Fig.2 Effect of ethanol fraction on proanthocyanidins extraction rate

从图2可以看出，当料液比为1∶20、超声功率为35W、盐酸用量为3.5mL时，随着乙醇体积分数的增加，昆仑雪菊原花青素的提取率相应提高，乙醇体积分数为60%vol时提取率最高。当乙醇体积分数高于60%vol时，原花青素提取率逐渐降低，确定昆仑雪菊原花青素的最佳提取乙醇体积分数为60%。

2.2.2 料液比对原花青素提取率的影响

图3 料液比对原花青素提取率影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on proanthocyanidins extraction rate

从图3可以看出，当乙醇体积分数为60%、超声功率为35W、盐酸用量为3.5mL时，随着料液比的增加，昆仑雪菊原花青素的提取率相应提高，料液比为1∶20时提取率最高。当料液比为高于1∶20时，原花青素提取率变化趋势趋于稳定，确定昆仑雪菊原花青素的最佳提取料液比为1∶20。

2.2.3 超声功率对原花青素提取率的影响

从图4可以看出，当乙醇体积分数为60%、料液比为1∶20、盐酸用量为3.5mL时，昆仑雪菊原花青素的提取率随超声功率的增加而得到相应提高，超声功率为40W时提取率最高。当超声功率高于40W时，原花青素提取率趋于稳定，考虑到能耗问题，选择昆仑雪菊原花青素的最佳提取超声功率为35W。

图4 超声功率对原花青素提取率影响Fig.4 Effect of ultrasoud power on proanthocyanidins extraction rate

2.2.4 盐酸用量对原花青素提取率的影响

从图5可以看出，当乙醇体积分数为60%、料液比为1∶20、超声功率为35W时，随着盐酸（0.1mol/L）用量的增加，昆仑雪菊原花青素的提取率增加，当盐酸用量高于3.5mL时，原花青素提取率降低，确定昆仑雪菊原花青素的最佳提取盐酸用量为3.5mL。

图5 盐酸用量对原花青素提取率影响Fig.5 Effect of hydrochloric acid content on proanthocyanidins extraction rate

2.3 响应曲面优化试验结果与分析

根据Box-Behnken中心试验方案进行4因素3水平试验，其结果见表2。

表2 响应面分析试验结果Table 2 Design and results of response surface methodology

按照Box-Behnken中心试验原理，利用Design-Expert 7.1.6软件对试验数据进行二次响应面回归分析，其结果见表2。通过回归分析可得出影响因素的一次效应、二次效应及其交互效应的关联方程，获得提取昆仑雪菊原花青素的多元二次模拟回归方程：y=1.69+0.042A+0.35B-0.05C+0.033D-0.18AB+0.12AC-0.17AD+0.097BC+0.19BD-0.12CD-0.27A2-0.54B2-0.27C2-0.13D2。决定系数R2=0.929，说明该模拟方程的拟合度较好[16-17]。

本试验采用F检验方法对模型的显著性进行分析，回归方程的方差分析结果（见表3），其二次响应面回归模型F值为13.170，并且p＜0.0001说明该方程模型极显著，可预测对不同萃取条件下原花青素的提取率。方程式中，一次项，二次项，交互项均与响应值回归关系显著，其中B、A2、B2、C2对原花青素的提取率的影响为差异极显著（p＜0.01），AB、AC、AD、BD在p＜0.05水平显著，其余项均不显著。该模型失拟项p值0.2383，大于0.05，模型失拟不显著，说明该模型有效，预测决定系数R2=0.9290，调整系数R2Adj=0.8590，说明两者存在高度相关[18]，因而该模型拟合度比较好，运用该模型可以较好地分析响应值的变化。从响应面回归方程F检验值可以得出，影响昆仑雪菊原花青素提取率大小的因素依次为料液比（B）＞乙醇体积分数（C）＞盐酸用量（D）＞超声功率（A）。

表3 二次响应面回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of quadratic response surface regression model

图6～图8是原花青素提取率响应值与相对应的影响因素：乙醇体积分数（C）、超声功率（A）、料液比（B）、盐酸用量（D）交互作用构成的三维空间响应面与等高线图，图6～图8中曲面颜色越深，说明对原花青素提取率的影响越显著，等高线形状越趋向于椭圆形交互作用越显著。结果得出料液比和超声功率，乙醇体积分数和料液比，盐酸用量和料液比，盐酸用量和乙醇体积分数这4组因素的交互作用显著，原花青素的提取率在一定程度上会随着4个因素的增加迅速增大，当达到实验所取各因素中心值时，提取率又会随这4个因素的增加而下降，整体呈现抛物线形状[19]。

图6表明，当乙醇体积分数为60%，盐酸用量为3mL，超声功率不变的情况下，随着料液比的增加，昆仑雪菊中原花青素的提取率迅速增大，而后逐渐下降[20]。

图7表明，当盐酸用量为3.5mL，超声功率为35W，料液比不变的情况下，随着乙醇体积分数的增加，原花青素的提取率逐渐增加。

图6 料液比与超声功率对原花青素提取率影响响应面与等高线图Fig.6 Response surface plot and contour map of effect of interaction between material/liquid ratio and ultrasonic power on proanthocyanidins yield

图7 乙醇体积分数与料液比对原花青素提取率的影响的响应面与等高线图Fig.7 Response surface plot and contour map of effect of interaction between ethanol volume fraction and material/liquid ratio on proanthocyanidins yield

图8表明，当乙醇体积分数固定在60%，超声功率固定35W，料液比不变的情况下，原花青素的提取率会随盐酸用量的增加而提高。

图8 盐酸用量与料液比对原花青素提取率影响响应面与等高线图Fig.8 Response surface plot and contour map of effect of interaction between hydrochloric acid dosage and material/liquid ratio on proanthocyanidins yield

2.4 工艺条件和验证试验

利用Desigh Expert软件得到最佳工艺条件为提取超声功率35W、乙醇体积分数为60%，料液比为1∶20，盐酸用量3.5mL在此条件下进行3次平行实验。昆仑雪菊原花青素平均提取率为1.76%（n=3，RSD=1.68%），与理论预测值1.79%相比，其相对误差约为0.03%，且重复性很好，说明优化结果可靠。

3 结论

响应面优化昆仑雪菊原花青素最佳提取工艺条件为超声功率为35W、料液比为1∶20、乙醇体积分数为60%、盐酸用量为3.5mL，实际提取率达到理论预测值的98.324%。

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