复发性流产与蜕膜组织中妊娠相关血浆蛋白A的关系研究

杨 君，王慧玲，华方方

复发性流产是指连续2次及以上的自然流产，是妊娠期妇女的常见并发症之一［1］。目前关于复发性流产的病因尚不完全清楚，约80%的流产者不存在生殖道感染、解剖、内分泌、遗传和自身免疫功能异常等病因［2］。妊娠相关血浆蛋白 A(PAPP－A)是由胎盘合体滋养层细胞和蜕膜细胞合成的母体血浆糖蛋白，研究显示其在早期配子的发育、受精卵的着床、妊娠的维持以及胎儿和胎盘的生长发育等方面均发挥重要作用［3］。其表达水平随着孕周的增加而增高，笔者在临床工作中发现PAPP－A水平在复发性流产孕妇蜕膜组织中的表达水平低于正常孕妇，本研究即探讨了蜕膜组织中PAPP－A水平与复发性流产之间的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 病例入选标准:(1)患者染色体检查正常，无家族性遗传病史，家族中未出现过自然流产者;(2)患者生殖道感染检测呈阴性;(3)抗心磷脂抗体、抗核抗体、抗精子抗体及抗子宫内膜抗体检查均为阴性;(4)无自身免疫性疾病、内分泌疾病等;(5)无心脑血管疾病及其他传染性疾病病史;(6)配偶生殖系统和精液功能正常;(7)无吸烟、酗酒等不良生活习惯。选择2010年6月—2012年6月我院收治的复发性流产孕妇39例作为复发性流产组 (RSA组)，年龄27～41岁，平均 (33.1±5.4)岁;孕期5～7周，平均(6.1±0.8)周。选择同时期在我院进行人工流产的健康早孕妇女30例作为对照组，年龄23～40岁，平均 (32.1±5.2)岁;孕期为5～8周，平均 (6.5±0.9)周。两组受试者的年龄、孕周间具有可比性 (t=0.143、0.217，P＞0.05)。

1.2 实验材料与仪器 蜕膜组织均通过负压吸引术获得，于液氮中保存使用;Trizol购自Invitrogen公司;反转录试剂盒购自大连宝生物;SYBY Green MiX购自罗氏生物;96孔板购自Applied Biosystems;小鼠抗人PAPP－A单克隆抗体购自美国Abcam公司;羊抗鼠二抗购自Santa－cruz公司;DAB显色液购自北京中杉生物技术有限公司;苏木精购自北京中杉生物技术有限公司;国产分析纯试剂;Real－time PCR扩增仪购自Applied Biosystems;LEICA RM2245石蜡切片机购自莱卡上海分公司;OLYMPUSBX5l显微镜购自日本奥林巴斯。

1.3 实验方法

1.3.1 荧光定量PCR(RT－PCR)分析PAPP－AmRNA水平

将蜕膜组织从液氮中取出，置于1 ml Trizol试剂中，匀浆后加入200μl的氯仿，振荡混匀后冰上放置5 min，12 000 r/min(离心半径13.5 cm)离心15 min，吸取澄清部分加入等体积异丙醇中，混匀后冰上静置10min，12 000 r/min离心15min，弃上清液，向离心管中加入1 ml预冷的75%乙醇溶液，轻轻振荡5下后8 000 r/min离心5 min，弃上清液，沉淀用焦碳酸二乙酯 (DEPC)处理的溶液溶解，定量后采用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，作为RT－PCR的模板。

PAPP－A引物，上游:5'－CTACTTGGATGTTAATGAGC－3';下游:5'－TCCTGCCAACTCCTCCTCTG －3'。Actin作为内参，上游:5'－AGCGGGAAATCGTGCGTGACA－3';下游:5'－GTGGACTTGGGAGAGGACTGG－3'，由上海英俊生物公司合成。引物合成后稀释为10μM。反应体系如下:2×SYBR®Premix ExTaqTM 10μl，上游引物和下游引物各0.6μl，cDNA模板1∶100稀释后取8.8μl，总体积20μl。按比例配制上述反应液后分装于96孔PCR板，每孔20μl，然后以1 000 r/min离心2 min。PCR反应条件如下:预变性:95℃，30 s;变性:95℃，3 s;退火延伸:60℃，30 s;构建溶解曲线。表达量的计算采用ΔΔt模式。

1.3.2 免疫组化分析PAPP－A水平 将RSA组和对照组蜕膜组织用石蜡包被，切成5μm厚的切片，贴于载玻片上进行脱蜡处理，结束后用磷酸盐吐温 (PBST)缓冲液冲洗3次，用3%过氧化氢－甲醇液浸泡除去内源性的过氧化氢酶，PBST缓冲液冲洗3次后将玻片置于柠檬酸缓冲液中，微波加热进行抗原修复，冷却至室温后PBST缓冲液冲洗3次，用10%的山羊血清室温封闭1 h，然后用10%山羊血清稀释的一抗工作液4℃孵育过夜。次日在室温回温1 h后用PBST缓冲液冲洗3次，用二抗工作液室温孵育30 min，PBST缓冲液冲洗3次后DAB显色2～10 min，边显色边观察，着色后用自来水冲洗掉显色液，苏木精复染30 s，然后梯度乙醇脱水并用中性树脂封固。同时设立阴性和阳性对照。阳性评定标准:所有切片均采用Motic Med 6.0数码医学图像系统分析。每张切片随机选取10个视野，放大400倍，分析阳性细胞占总细胞数的比例，分为4个等级，阴性 (－):阳性细胞数 ＜5%;弱阳性(+):阳性细胞数5%～25%;中等阳性 (++):阳性细胞数26%～50%;强阳性 (+++):阳性细胞数＞50%。并采用Motic Med 6.0数码医学图像系统对标本进行定量分析。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，计量资料采用±s)表示，采用t检验;计数资料采用χ2检验;相关影响因素的分析采用Logistic回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RSA组和对照组蜕膜组织中PAPP－A mRNA水平比较从蜕膜组织中提取的RNA经紫外线分析，光密度 (OD)260/OD280为1.9～2.0，说明RNA纯度较高，未受到DNA和蛋白质污染。并采用反转录试剂盒反转录为cDNA，作为RT－PCR的模板。RSA组蜕膜组织中PAPP－A mRNA水平较对照组下降，差异有统计学意义 (t=3.152，P＜0.05，见图1)。

图1 RSA组和对照组蜕膜组织中PAPP－A mRNA水平比较Figure1 Comparison of PAPP－A mRNA between RSA group and control group in basal deciduas tissues

2.2 RSA组和对照组蜕膜组织中PAPP－A水平比较PAPP－A表达于蜕膜细胞的胞质中 (见图2A)。两组PAPP－A表达程度间差异有统计学意义 (u=4.995，P=0.000)，其中RSA组PAPP－A表达以强阳性为主，对照组主要以弱阳性为主 (P＜0.05，见表1)。对RSA组和对照组标本进行定量分析显示，RSA组PAPP－A表达水平较对照组下降 (t=2.591，P＜0.05，见图2B)。

2.3 PAPP－A蛋白与复发性流产的关系 以PAPP－A水平、年龄、孕周为自变量，以是否发生复发性流产为因变量进行Logistic回归分析，结果显示PAPP－A水平是导致复发性流产的危险因素之一〔b=1.722，OR=5.596，95%可信区间(2.406，13.017)，P=0.004〕。Hosmer－Lemeshow 拟合优度检验结果显示PAPP－A水平对复发性流产的预测具有较好的校准度 (χ2=3.158，P＜0.05)。

表1 RSA组和对照组蜕膜组织中PAPP－A的表达程度比较Table 1 Comparison of PAPP－A protein in RSA group and control group in basal deciduas tissues

图2 RSA组和对照组蜕膜组织中PAPP－A的组织分布及水平比较Figure 2 Comparison of PAPP－A protein location and level between RSA group and control group in basal deciduas tissues

3 讨论

复发性流产占妊娠总数的1%，给孕妇心理和身体造成了极大的损伤，目前已经成为临床研究的焦点［4］。但复发性流产的发病机制比较复杂，包括染色体异常［5］、内分泌异常［6］、免疫功能异常［7］、生殖器异常、感染因素［8］、全身性疾病、创伤刺激、不良生活习惯及环境因素等。但是约80%的复发性流产没有明确的病因［9］。近年来，随着临床研究的不断深入，发现PAPP－A在复发性流产孕妇中表达异常，因此本研究探讨了其与复发性流产之间的关系，旨在为临床诊断复发性流产提供一定的参考价值。

PAPP－A是与妊娠密切相关的一类大分子糖蛋白，近年来，研究显示其在早期胚胎发育、受精卵着床、妊娠期维持、胎儿和胎盘生长以及发育过程中发挥重要作用［10］。PAPP－A主要由胎盘滋养层合体细胞和蜕膜细胞产生，然后分泌入血，从妊娠后第5周起可在孕妇血清中检测到，并随着孕周的增加其水平逐渐升高，到妊娠末期达到最高峰，产后水平逐渐下降［11］。目前PAPP－A已成为临床早孕诊断和胎儿健康程度的主要监测指标。笔者在长期临床研究中发现，复发性流产孕妇血清中PAPP－A水平明显低于正常孕妇，这一结果跟目前部分报道一致［12］。

本研究显示，与对照组比较，复发性流产孕妇蜕膜组织中PAPP－A mRNA的水平明显下降;为了进一步分析PAPP－A水平，采用免疫组化的方法分析了蜕膜组织中PAPP－A的表达变化，结果显示复发性流产孕妇蜕膜组织中PAPP－A水平明显低于对照组，蜕膜组织中PAPP－A的表达下调导致了入血的PAPP－A水平下降，所以表现为复发性流产孕妇血清中PAPP－A水平低于对照组孕妇。进一步行Logistic回归分析显示PAPP－A水平下调是导致复发性流产的危险因素，提示其在复发性流产诊断中具有较好的准确性。

综上所述，PAPP－A在复发性流产蜕膜组织中表达水平明显下调，其下调是导致发生复发性流产的原因之一。

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