西藏地区藏北嵩草附着乳酸菌的理化特性

高 静，郭旭生，王国成

(1．兰州大学草地农业科技学院,甘肃 兰州730020； 2.兰州大学生命科学学院，甘肃 兰州730000；3.兰州大学青藏高原生态系统管理国际中心，甘肃 兰州 730000)

高寒草地畜牧业是西藏农牧民赖以生存的基础，是西藏经济发展的主要支柱，更是国家生态安全的基本保证[1]。西藏地区被称为“世界第三极”，气候极端，生态环境脆弱，畜牧业发展面临牧草生长缓慢、畜群结构不合理及天然草地退化等问题，限制了西藏草地畜牧业的快速发展。青贮饲料不仅适口性好、消化率高，还能长期保存，且受气候和外界环境影响较小，可以有效改善西藏饲料短缺的困境[2-3]。因此，青贮饲料是解决西藏地区草畜季节性供应不平衡的理想措施之一。

目前，我国主要是通过购买国外商品乳酸菌进行青贮饲料的调制，这些商品菌适宜的生长温度一般是25 ℃，但西藏地区牧草收获期气温较低，一般只有15 ℃。同时，有关乳酸菌筛选的研究主要为常规条件下的乳酸菌研究，而就极端环境中乳酸菌有关理化特性和应用基础等方面的研究鲜有报道。我国大多乳酸菌在青贮饲料中的研究主要为利用商品化乳酸菌制剂进行试验[4-7]，而有关牧草中天然附着乳酸菌的筛选研究与应用方面还十分薄弱，最近几年才有所报道[8-11]。关于我国高寒地区乳酸菌的研究有高原酸奶、青贮饲料和类开菲尔粒中提取的相关报道[12]，但有关高寒地区牧草附着乳酸菌的研究还未见报道。在我国高寒高海拔地区，通过牧草青贮发酵可以获得优质的青贮饲料，这些青贮饲料色绿、酸香味浓、适口性好，几乎没有二次发酵的现象[13-14]，说明在我国高寒地区或许存在可以在低温环境中发酵饲料的特殊乳酸菌。针对以上情况，开展我国高寒地区牧草附着乳酸菌特性的研究十分必要，而对其与其它生境提取的乳酸菌理化性质的比较研究也很重要。因此，本研究以西藏高寒地区分布范围广、面积大、牧草饲用价值较高的藏北嵩草(Kobresialittledalei)为原料[15-16]，对其附着乳酸菌进行鉴定，并对比研究其与对照菌株的生理生化等特性，明确青藏高原乳酸菌特性，为其在饲料青贮、酸奶发酵等应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1菌株 试验所用乳酸菌菌株是从2010年7月初采自西藏高寒草甸的藏北嵩草中分离纯化，并采用传统培养法和16S rRNA序列分析鉴定后得到的，详见杨杨等[17]的方法。将于-80 ℃保存的菌株活化后，接种到MRS斜面培养基上培养，在4 ℃条件下保存备用。

1.2培养基 试验用培养基参考凌代文[18]的方法配制。

MRS培养基：葡萄糖20.00 g，牛肉膏10.00 g，蛋白胨10.00 g，酵母提取物5.00 g， K2HPO45.00 g，柠檬酸铵2.00 g，MnSO40.25 g，CaCO32.00 g，乙酸钠5.00 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，琼脂粉20.00 g，1 mL吐温-80，加蒸馏水1 000 mL，调pH值至6.20，121 ℃下灭菌15 min。

PY基础培养基：100 mL蒸馏水中加入1.00 g酵母提取物，0.50 g胰酶解酪朊，0.50 g蛋白胨，4.00 mL盐溶液。其中盐溶液为1 000 mL蒸馏水中溶入10.00 g碳酸氢钠，1.00 g磷酸二氢钾，0.48 g MgSO4·7H2O，0.20 g氯化钙，1.00 g磷酸氢二钾，2.00 g氯化钠。

1.3试验仪器和设备 超净工作台(YJ-875，苏州净化设备公司)，高压灭菌锅 (MLS-3780，三洋公司)，pH仪(E-201-C，上海雷磁仪器厂)，恒温培养箱。

1.4试验设计 试验采用随机区组设计，研究3种分离的乳酸菌肠膜明串珠菌肠膜亚种、融合魏斯氏菌和食物魏斯氏菌在不同温度、不同pH条件下的生长特性及糖发酵、耐盐等特性，并以相对应的3种标准菌作为对照。

1.5试验测定项目

1.5.1不同温度条件下各菌株的生长特性 将备好的MRS培养液以5 mL量分装试管，于121 ℃高压灭菌15 min。将试验菌株以相同的接种量(0.1 mL)接入培养液中，摇匀，塞子封口，各设两个重复，分别放在温度为4、10、15、25、30、40和50 ℃的水浴锅中培养，其中4、10 ℃培养14 d，40、50 ℃培养7 d，其余培养2 d，观察菌株的生长情况。

1.5.2不同pH条件下各菌株的生长特性 所用培养基是将MRS培养液用盐酸或氢氧化钠调pH值至所需酸碱度，即pH值分别为3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0和9.5。同上步骤，将试验菌的液体培养基以100 μL的接种量分别接入灭过菌的培养基中，各设两个重复，置于30 ℃恒温培养箱培养7 d后，观察菌株的耐酸碱能力。

1.5.3各菌类的耐盐特性 所用培养基是在MRS培养液中加入所需NaCl，将备好的MRS培养液(3% NaCl、6.5% NaCl和18% NaCl)以5 mL量分装入试管。经121 ℃高压灭菌15 min，将试验菌株以相同的接种量(0.1 mL)接入所需培养基中，各设两个重复，置于30 ℃恒温培养箱中培养7 d并观察菌株的耐盐能力。其中NaCl的百分含量是指100 mL培养液中含有NaCl的克数。

1.5.4糖源利用试验 按Cai等[19]相关文献介绍，本次糖源利用试验共挑取了乳糖、阿拉伯糖、蔗糖、葡萄糖、D-核糖、苦杏仁苷、甘露糖、麦芽糖、鼠李糖、棉子糖、水杨苷、果糖、半乳糖、密二糖、纤维二糖、葡萄糖酸盐、七叶苷、山梨醇和甘露醇，共19种糖源。试验采取了糖发酵生化反应管法(发酵试剂由杭州天和微生物试剂有限公司提供)。试验同时设置无糖处理(培养基中末加所需测定的糖。但接种试验菌株)和空白处理(培养基中加入所需测定的糖，但末接种试验菌株)，各设两个重复。操作方法参照生化反应管的说明书进行(将已经培养好的不同试验菌用接种针分别接入含有不同糖的反应管中，放置30 ℃的培养箱中培养2 d，观察发酵情况)。

1.5.5精氨酸产氨试验 采用的培养基是在PY基础培养液中加入精氨酸液。将试验菌株分别接种于含精氨酸和不含精氨酸的培养基，以作对照。30 ℃的培养箱中培养3 d，再将培养好的培养液倒入比色皿中，添加奈氏试剂，如果有氨产生则会有橙黄色或黄褐色沉淀出现。反应现象明显强于对照组认为是阳性反应。

配置精氨酸液：在10 mL蒸馏水中加入1.50 g·L-1精氨酸和0.05 mL半胱氨酸， pH值调至7.0，灭菌，吸取3滴到3 mL PY基础培养液中。

奈氏试剂：A液为50 mL的蒸馏水中加入20.00 g KOH；B液为5.00 g KI和10.00 g HgI2溶入至50 mL蒸馏水所得溶液。A液和B液混合均匀，过滤，存于棕色瓶备用。

2 结果

2.1藏北嵩草分离乳酸菌的鉴定结果 本试验分离得到19个菌株，经过传统培养法和16S rRNA序列分析，分离鉴定出3种菌，分别是肠膜明串珠菌肠膜亚种2株，融合魏斯氏菌11株，食物魏斯氏菌6株(表1)。

2.23种试验菌的生理特征比较 从藏北嵩草分离的3种试验菌(融合魏斯氏菌、食物魏斯氏菌和肠膜明串珠菌肠膜亚种)都能在4 ℃下生长，而且在10 ℃时生长活力旺盛，但相同的3种对照菌在10 ℃才能微弱生长甚至不生长(表1)。试验菌株在6.5%的NaCl培养基中生长良好，部分菌株还能在18%的NaCl培养基中生长，而对照菌株未生长。在不同pH值下，大多菌株可以在pH值为4.0～9.0的范围内生长，部分试验菌株能在pH为3.0或9.5的条件下生长，而对照菌株在pH为3.0或9.5时未生长。

2.33种试验菌的生化特征比较 3种试验菌都可以利用葡萄糖产生酸；魏斯氏属中除了1个菌株外，其它菌株都能利用阿拉伯糖；在半乳糖的利用情况上，魏斯氏属有15个菌株可利用半乳糖，而有2个菌株为不确定反应(表2)。对照菌组融合魏斯氏菌不能利用棉籽糖、阿拉伯糖和蜜二糖，但能发酵半乳糖、纤维二糖、麦芽糖、D-核糖等；食物魏斯氏菌株能利用阿拉伯糖，但不能利用半乳糖等；但本试验中提取魏斯氏属菌株的糖源利用试验表明，提取菌株均能利用阿拉伯糖、蜜二糖、棉籽糖、纤维二糖、麦芽糖、果糖和蔗糖等。同样，试验菌株肠膜明串珠属除了不能利用葡萄糖酸盐和鼠李糖外，均可利用葡萄糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、纤维二糖、棉籽糖、果糖、蔗糖、半乳糖、七叶苷、密二糖、水杨苷和苦杏仁苷。根据肠膜明串珠属乳酸菌的糖源利用鉴定方法，常规条件下的肠膜明串珠肠膜亚种对麦芽糖、半乳糖、D-核糖、甘露糖、水杨苷、密二糖的发酵能力较差，一般也不能利用精氨酸产氨，但是本试验所提取的试验菌可以利用上述几种糖类，并且可以利用精氨酸产氨。

表1 3种试验菌及其对照菌的生理特征Table 1 Physiological characteristics of three kinds of test bacteria’s and their controls

表2 3种试验菌及其对照的生化特征Table 2 Biochemical characteristics of three kinds of test bacteria’s and their controls

3 讨论

李文斌等[22]和张刚[23]报道，当温度为30～40 ℃时常规明串珠和魏斯氏菌生长旺盛，且其最适pH为5.5～6.2，当pH≤5时可以生长，pH<4.4 则停止生长，而在初始碱性或中性环境中生长速率降低。在4 ℃的条件下，从藏嵩草中分离的乳酸菌能够生长，而温度达到10 ℃时生长旺盛，但本试验的菌株对温度的要求远远低于从日本东京的青贮饲料中分离出的3种菌株(食物魏斯氏菌、融合魏斯氏菌和肠膜明串珠菌肠膜亚种)，它们在10 ℃条件下只能微弱生长[19-20]。青藏高原高寒环境的特殊性可能是造成本研究中乳酸菌对低温适应特性的主要原因。另外，本研究表明，部分菌株还能在pH为3的条件下生长，体现出较强的耐酸能力。由此可见，从青藏高原极端环境中分离的乳酸菌具有相对较强的环境适应性和对环境胁迫的耐受性。

从目前的研究资料来看，食物魏斯氏菌和融合魏斯氏菌多分离自人类或其他动物[24-25]。研究表明，仅从形态和菌落特征方面是很难区分这两种菌的，但可以从发酵的糖类区分二者，食物魏斯氏菌能发酵阿拉伯糖，但是不能发酵木糖和半乳糖，而融合魏斯氏菌不能发酵棉籽糖、阿拉伯糖和蜜二糖，但是能发酵核糖、半乳糖、麦芽糖和纤维二糖等[18,26]。虽然有研究表明，玉米(Zeamays)青贮饲料附着的融合魏斯氏菌乳酸菌可利用阿拉伯糖，但是其利用能力比较弱，分离的食物魏斯氏乳酸菌不能完全利用半乳糖发酵产酸[27]。但本试验发现，由于高寒环境中魏斯氏乳酸菌对碳源的利用可能比其它环境中分离出的菌种更具广泛性，因此从藏嵩草中分离的融合魏斯氏菌绝大部分菌株均能发酵阿拉伯糖，且分离鉴定的食物魏斯氏乳酸菌都可以利用半乳糖。明串珠菌属广泛分布于植物、泡菜、发酵乳制品和青贮料中。本研究分离的菌株都可以完全利用甘露糖、水杨苷、D-核糖、蜜二糖和半乳糖，而对照菌肠膜明串珠菌肠膜亚种对这些糖的利用效率不高[18,24]。从碳源利用的角度看，本研究中的肠膜明串珠菌肠膜亚种对碳源的利用比在其它环境中分离得到的菌株更强。

4 结论

通过对各菌种生理生化特性的比较研究发现，本研究分离得到的魏斯氏乳酸菌和明串珠菌对生长环境具有较强的耐受性，温度在4～40 ℃条件时，大多菌株都能生长，有些菌株甚至能在50 ℃的条件下生长。在耐酸碱试验中，本研究中的菌株表现出较强的耐酸碱性，当pH为3.0和9.5时有些菌株依旧能够生长。本研究中分离出的食物魏斯氏乳酸菌可以发酵半乳糖，融合魏斯氏菌可以发酵甘露醇、密二糖和阿拉伯糖，这表明在利用糖源方面，高寒乳酸菌比常规乳酸菌更广泛。因此，青藏高原极端环境中分离的乳酸菌不仅利用的糖源更广泛，而且环境适应性和对环境胁迫的耐受性相对较强，这些特殊性有助于进一步进行青藏高原乳酸菌的开发应用研究。

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