响应面法优化超临界CO2提取青花椒麻味成分的工艺条件

卢友庆，薛小辉，蒲 彪

（四川农业大学食品学院，四川雅安625014）

日常生活中所说的青花椒是指的青花椒的干燥果皮[1]。花椒在中国作为特色辛香料和中药材有着悠久的历史，四川汉源的花椒自唐代开始就为贡品，因此，被称为“贡椒”。花椒在中国具有较大的种植面积，山东泰安、山西运城、陕西韩城、四川金阳和重庆江津都是花椒的生产基地，已成为各地的主要经济作物。

青花椒的主要成分有挥发油、生物碱、酰胺类物质、木脂素、香豆素和脂肪酸，另外还有一些含量较少的成分比如烃类、甾醇及黄酮甙类等[2-4]。挥发油和酰胺类物质是花椒的主要风味物质。酰胺类物质为花椒的麻味成分，除了作为调味品以外，它还具有抑菌杀虫[5-7]、抗氧化作用[8]、抗癌作用[9]、抑制血小板凝固和减少心脑血管疾病等作用。目前多数研究主要针对花椒挥发油的研究，对花椒麻味成分的研究较少，特别是针对其高效萃取分离方法的研究更少。分析花椒麻味成分的组分与找出更有效的萃取分离方法对促进花椒麻味成分的研究进展具有重要意义。花椒风味物质的总萃取量是实际生产中衡量花椒萃取工艺好坏的重要指标之一，可为花椒麻味成分的萃取提供数据参考。本文主要针对超临界CO2的高效快速的萃取特点，对其工艺进行研究，此工艺更适合工厂大量萃取分离花椒麻味成分。本文采用响应面法优化花椒麻味成分的提取工艺旨在克服传统提取方法中溶剂残留、提取率低的问题，便于提取物更好的应用到食品添加剂和医药等领域。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

青花椒 2012年四川金阳产的青花椒；CO2气体 纯度大于99%；无水乙醇 分析纯。

UV-3000PC型扫描型紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器；DHG-9245A型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；Es-10K型电子天平、FA2004型电子天平、RE52-99型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；SHBⅢ型循环水多用真空泵 菏泽市鑫源仪器仪表有限公司；LX-04型多功能粉粹机 上海江信科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 青花椒麻味成分标准曲线的绘制 本实验中采用的青花椒麻味成分标准品为实验室内自制标品。将花椒麻味成分的粗提物经过D152树脂脱色、硅胶柱层析、聚酰胺层析和凝胶层析，得到的物质经红外光谱和质谱分析，与现有的花椒酰胺类物质进行对比，推断为羟基-α-山椒素或羟基-β-山椒素。此物质是花椒麻味成分的主要组成成分，因此以该物质作为花椒花椒麻味成分的标品绘制花椒麻味成分的标准曲线。

1.2.2 青花椒麻味成分的提取工艺 青花椒→干燥→粉碎→过筛→称重（称取150g）→装料→控制合适的温度、压力等实验条件→在超临界状态下萃取由分离釜Ⅱ获得麻味物质。

1.2.3 单因素实验 称取花椒150g按照1.2.2提取花椒麻味物质，称取0.5g麻味物质，溶于1mL 70%乙醇中，稀释20倍后取3mL放入装有1g D152树脂的三角瓶中，保鲜膜封口放在振荡培养箱中过夜，取滤液稀释10000倍后在254nm条件下测其紫外吸光值，根据标准曲线计算花椒麻味物质的含量，然后换算得到150g花椒中麻味物质的质量。

选取花椒粒度、萃取时间、萃取温度、萃取压力、分离器Ⅰ温度进行单因素实验，以麻味物质的萃取率为指标，指标的计算如下：

1.2.4 Box-Behnken中心组合设计实验 根据单因素实验结果，以萃取压力、萃取温度和萃取时间作自变量，进行三因素三水平的Box-Benhnken中心组合实验，固定花椒粒度为200目；分离器温度Ⅰ为30℃、压力为12MPa；分离器Ⅱ压力为8MPa，温度为37℃；精馏柱压力5MPa，温度依次为35、40、45、50℃；CO2流量为19L/h。以花椒麻味物质的质量为响应值，优化提取工艺，响应面实验因素水平及编码如表1所示。

表1 花椒麻味物质提取响应面实验因素水平编码表Table 1 Coded variables and their coded levels in response surface analysis

1.3 数据分析

利用Design Expert 8.0分析软件及Excel程序对实验结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 花椒麻味成分标准曲线

将花椒麻味成分标品进行不同倍数的稀释，得到的标准曲线方程为Y=0.02936X，R2=0.9999，标准曲线如图1所示。

图1 花椒麻味成分标准曲线Fig.1 The standard curve of spicy component

2.2 单因素实验

2.2.1 花椒粒度的影响 萃取压力为32MPa、温度为55℃；分离器Ⅰ压力为12MPa，温度为30℃；分离器Ⅱ压力为8MPa，温度为37℃；精馏柱压力5MPa，温度分别为35、40、45、50℃；CO2流量为19L/h。考察10、20、40、60、80目花椒萃取2h后花椒麻味物质的质量和萃取总量，结果如图2所示。

图2 花椒粒度对花椒麻味物质的质量和萃取总量的影响Fig.2 The effect of finness of pulverization spicy compenent weight and the extraction gross

由图2可知，目数对麻味物质和萃取总量的影响趋势大致相同，随着目数的增加两者含量都出现增长趋势，麻味物质的质量和萃取总量在20目的时候达到最大值，随后出现急剧的下降趋势，40目以后两者的下降明显减少趋于稳定。随着粉碎程度的增加，对花椒的破坏越大，越有利于CO2溶解花椒中的麻味成分和其他有效成分，但是在高压下CO2对花椒具有压实作用，粒度过小高压下会将原料压实，减少原料之间的空隙，因此也减少了CO2与原料的接触，从而降低萃取效果。因此20目是最佳的花椒粉碎粒度，此粒度下CO2会充分的经过原料内部细小的空隙，CO2与花椒的接触面积达到最大。

2.2.2 萃取时间的影响 萃取压力为32MPa、温度为55℃；分离器Ⅰ压力为12MPa，温度为30℃；花椒目数为20目。考察萃取时间1.0、1.5、2.0、2.5、3h对花椒麻味物质的质量和萃取总量的影响，结果如图3所示。

图3 萃取时间对花椒麻味物质的质量和萃取总量的影响Fig.3 The effect of extraction time spicy compenent weight and the extraction gross

由图3可以看出，随着萃取时间的增加，花椒麻味物质的质量在1.5h时达到最大值，之后随着时间的延长逐渐减少，2h和2.5h的花椒麻味物质的质量基本相同，但在3h的时候花椒麻味物质的质量又得到增加，这可能是因为1.5h正好是一个分离周期，在1.5～3h内又进行了一次分离，将萃取釜和精馏柱中及循环系统中的花椒麻味物质分离出来，但是相比较第一个分离周期分离得到的花椒麻味物质还是有所减少，这可能是因为还有部分花椒麻味物质存在CO2循环系统中。时间太短不能充分的提取出所有麻味物质，时间过长花椒麻味物质会随着CO2进入气体循环系统，从而减少其得量。萃取总量随着萃取时间的增加而增加，但是增长比较缓慢。结合两者选择1.5h为最佳萃取时间。

2.2.3 萃取温度的影响 分离器Ⅰ压力为12MPa、分离器Ⅰ温度为30℃、萃取压力为32MPa、萃取时间1.5h、花椒目数20目条件下，考察萃取温度分别为35、40、45、50、55℃对花椒麻味物质的质量和萃取总量的影响，结果如图4所示。

由图4可知，麻味物质的质量和萃取总量在45℃时都达到最大值。温度太低CO2的溶解力较低，随着温度的升高溶解力增加，但是萃取温度达到45℃以后CO2的密度降低，萃取率也会降低。因此45℃为最佳萃取温度。

图4 萃取温度对花椒麻味物质的质量和萃取总量的影响Fig.4 The effect of extraction temperature spicy compenent weight and the extraction gross

2.2.4 分离器Ⅰ温度的影响 萃取压力为32MPa、萃取温度为45℃、分离器Ⅰ压力为12MPa、萃取时间1.5h条件下，考察分离器Ⅰ温度分别为30、35、40、45、50℃对花椒麻味物质的质量和萃取总量的影响，结果如图5所示。

图5 分离器Ⅰ温度对花椒麻味物质的质量和萃取总量的影响Fig.5 The effect of separatorⅠtemperature spicy compenent weight and the extraction gross

由图5可以看出，分离器Ⅰ温度在实验范围内最小值时两者的量最高，随着温度升高反而减小，花椒麻味物质的分离主要在分离器Ⅰ中进行，分离器温度太高，花椒麻味物质会随着CO2进入循环系统，得量降低。设备分离器Ⅰ的最低设定温度为30℃，因此30℃为最佳的分离温度。

图6 萃取压力对花椒麻味物质的质量和萃取总量的影响Fig.6 The effect of extraction press spicy compenent weight and the extraction gross

2.2.5 萃取压力的影响 萃取温度为45℃、分离器Ⅰ压力为12MPa、分离器Ⅰ温度为30萃取温度为45℃、分离器Ⅰ压力为12MPa、萃取时间1.5h条件下，萃取时间1.5h条件下，考察萃取压力分别为22、25、28、31、34MPa对花椒麻味物质的质量和萃取总量的影响，结果如图6所示。

由图6可知，萃取压力在28MPa时麻味物质的质量和萃取总量最高。萃取压力与CO2的溶解力和CO2与花椒的接触面积有着复杂的关系，并不是压力越大越好。

2.3 响应面优化超临界CO2提取工艺

2.3.1 响应面实验设计及结果 由Design Expert（8.0版）统计分析软件的实验设计功能可知，三因素三水平的中心组合设计包括15个实验方案，具体的实验方案及实验结果如表2所示。

表2 花椒麻味物质提取响应面实验设计及结果Table 2 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

2.3.2 回归方程的建立检验 据表2结果，建立花椒麻味物质的质量与萃取压力A、萃取温度B、萃取时间C的三因素三水平回归方程为：Y=2.51+0.19A-0.27B-8.087E-0.03C-0.33AB+0.11AC+0.091BC-0.47A2+0.43B2-0.15C2。方差分析见表3。

由表3的方差分析可知，回归方程的失拟性检验p=0.1124，差异不显著，表明所选用的二次回归模型是适当的；回归方程的显著性检验p=0.0002，差异极显著，说明该模型的拟合程度较好，模型成立。

各因素对花椒麻味物质质量的影响程度大小依次为：萃取温度（B）＞萃取压力（A）＞萃取时间（C），其中萃取温度、萃取压力呈极显著影响，萃取时间影响不显著。考察因素间的交互作用，由方差分析表可知，AB存在极显著的交互作用，AC存在显著的交互作用。综上，在α=0.05显著水平剔除不显著项，得到优化后的方程为：Y=2.51+0.19A-0.27B-0.33AB+0.11AC-0.47A2+0.43B2-0.15C2。

用Design Expert 8.0软件根据响应方程绘制AB和AC的响应曲面分析图，结果见图7、图8。

由图7可以看出，花椒麻味物质的质量随着萃取温度的升高而降低，45℃以后又升高，但是趋势不是很明显，与单因素时萃取温度的走势有一定的差异，这可能是由于萃取压力与萃取温度之间存在极显著交互作用。

图7 萃取压力与萃取温度的交互作用Fig.7 The effects of extraction press and extraction temperature

表3 花椒麻味物质提取的响应面实验结果方差分析表Table 3 Analysis variance of the constructed regression equation for the weight of spicy compenent

图8 萃取压力与萃取时间的交互作用Fig.8 The effects of extraction press and extraction time

由图8可知，花椒麻味物质的质量随着萃取压力增加的变化趋势是先升高后降低，随着萃取时间增加的变化趋势是增加速率逐渐减少的增加过程，这与萃取时间、萃取压力的单因素实验比变化趋势有一定差异，可能原因是萃取压力与萃取时间之间存在显著交互作用。

2.3.3 验证实验 由软件分析得最优条件为：萃取压力为28.8MPa、萃取温度45℃、萃取时间89.1min，此时花椒麻味物质的理论萃取质量为3.35g。考虑到工厂实际操作，修正萃取压力为29MPa，萃取时间为89min。在分离器Ⅰ压力为12MPa、分离器Ⅰ温度为30℃、分离器Ⅱ压力为8MPa、分离器Ⅱ温度为37℃、精馏柱压力5MPa、精馏柱温度依次为35、40、45、50℃，CO2流量为19L/h下进行3次验证实验，实际萃取质量为3.3g，相对误差为1.49%，说明运用响应面优化得到的模型参数准确可靠。

3 结论与讨论

3.1 本实验建立的超临界CO2提取花椒麻味物质的条件优化数学回归模型为：Y=2.51+0.19A-0.27B-0.33AB+0.11AC-0.47A2+0.43B2-0.15C2，采用此模型在本实验范围内能较准确地预测花椒麻味物质的质量。

3.2 通过实验结果的方差分析可知，在本实验范围内各因素的影响程度依次为：萃取温度（B）＞萃取压力（A）＞萃取时间（C），其中萃取温度、萃取压力呈极显著影响，萃取时间无显著影响，AB之间存在极显著的交互作用，AC之间存在显著的交互作用。确定的最佳工艺条件为萃取压力为29MPa，萃取温度45℃，萃取时间89min，分离器Ⅰ压力为12MPa，分离器Ⅰ温度为30℃、分离器Ⅱ压力为8MPa、分离器Ⅱ温度为37℃、精馏柱压力5MPa，精馏柱温度依次为35、40、45、50℃，此时花椒麻味物质的萃取质量为3.3g，萃取率为2.2%。

3.3 目前，对花椒麻味物质提取的研究一般只以得到的萃取物的总量作为参考指标，本实验采用实验室自制的花椒麻味物质标品所得标准曲线进一步得到萃取物中花椒麻味物质的准确含量，能更为准确和全面地考察实验因素的影响，得到的回归模型和工艺参数可信度高，能较为准确的预测实际值。响应实验所得到的150g花椒麻味物质含量比单因素实验高，表明响应面优化超临界CO2提取花椒麻味物质的工艺具有可行性，可为实际生产研究提供一定的数据参考。

3.4 目前在工业上，花椒风味物质的提取主要是植物油浸提法、超临界CO2萃取，但是目前的研究超临界CO2萃取物大部分都是花椒精油与花椒麻味物质的混合物[10]，没有将二者有效的分离开，不能充分的应用到医药等方面。同时本实验设备具有精馏柱达到了多级分离的效果，使花椒麻味物质与花椒所含的其他物质得到很好的分离。

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1997：13-53.

[2]庄士宏.花椒精油提取及其生物活性测定研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2002.

[3]肖崇厚，杨松松，洪筱坤.中药化学[M].上海：科学技术出版社，1999：103-109.

[4]孙小文，段志兴.花椒属药用植物研究进展[J].药学学报，1996，31（3）：231-240.

[5]陈文学，李婷，侯晓东等.香辛料提取物抑菌作用的研究[J].中国酿造，2007，147（9）：12-14.

[6]高逢敬，蒲彪.青花椒香气成分的抑菌性研究[J].四川食品与发酵，2007，43（3）：28-30.

[7]Bafi-Yeboa NF，Arnason JT，Baker J，et al.Antifungal constituents of Northern prickly ash，Zanthoxylum americanum Mill[J].Phytomedicine，2005，5（12），370-377.

[8]Yun-Chin Chung，Chin-Tzu Chien，Kai-Yun Teng，et al.Antioxidative and mutagenic properties of Zanthoxylum ailanthoides Sieb&zucc[J].Food Chemistry，2006，97（3）：418-425.

[9]Da Silva，Saulo L，Figueiredo，et al.Chemotherapeutic potential of the volatile oils from Zanthoxylum rhoifolium Lam leaves[J].European Journal of Pharmacology，2007，576（1-3）：180-188.

[10]王家良.超临界CO2萃取花椒油树脂的研究[J].中国调味品，2007，2（2）：39-46.