木瓜蛋白酶酶解谷朊粉制备抗氧化多肽的研究

刘树兴，乔晓林

(陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西西安710021)

谷朊粉(Vital wheat gluten)又称活性小麦面筋蛋白，是营养丰富、物美价廉、氨基酸组成齐全的纯天然植物性蛋白源，是小麦淀粉生产的副产物，其蛋白质含量达70%以上。含有较多的疏水性氨基酸和一定数量的碱性氨基酸，具良好的成膜性、延展性和吸水乳化性等特点，在食品添加剂中作为面粉改良剂和营养强化剂已有广泛的用途［1－4］，而对于谷朊粉的综合利用和功能开发还有待深入研究。生物活性肽(Bioactive peptides，BAP)来源广泛，目前已成为世界范围内的研究热点。特别是抗氧化肽，它具有消除自由基、抑制或减缓氧化反应的特点，可用于改善食品品质、延长食品的保质期，减轻生物体内自由基对机体的损伤等。近年来，由于化学抗氧化添加剂的不安全性，高效低毒的天然食品抗氧化剂已成为目前研究的一大热点。抗氧化肽可以抑制体内自由铁离子、血红蛋白、脂氧合酶和体外单线态氧催化的脂肪酸败作用，也能抑制多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，PPO)的活性以及可直接与PPO的催化产物醌作用阻止黑色多聚氧化物的形成，降低酶促反应的速度。同时还具有重金属清道夫和过氧化氢分解促进剂作用，可降低自氧化速率，减少脂肪过氧化氢含量，减少自由基生成，在动物饲料和人类食品市场中具有巨大的开发前景。国外相关报道表明，通过酶解小麦蛋白可获得生物活性肽(如阿片肽和抗氧化肽等)［5－8］。而国内对此方面的研究仍处于初级阶段。虽有类似研究报道，但工艺条件相对复杂，不适合工业化生产。本研究采用木瓜蛋白酶对小麦面筋蛋白进行酶法降解制备抗氧化活性粗肽，并对其工艺条件进行优化，以DPPH自由基清除率及多肽含量为判定指标，以获得具有较高抗氧化活性的酶解产物，进一步利用单因素实验结合正交实验，确定该酶对小麦面筋蛋白的最适作用条件。以期为谷朊粉制备抗氧化肽的工业化生产提供理论依据，拓宽谷朊粉的应用范围，提高其生产附加值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

谷朊粉 陕西咸阳面粉厂;木瓜蛋白酶0.5～2U/mg solid、酪蛋白(纯度为80%)Sigma公司;双缩脲试剂、氢氧化钠、三氯乙酸等 分析纯试剂，天津市天力化学试剂有限公司。

UV－2600/2600A紫外可见分光光度计 龙尼柯(上海)仪器有限公司;BS245分析天平、PB－10型精密酸度计 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;78－1型磁力加热搅拌器 杭州仪表电机厂;SC－3610低速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co，Lid;HH－S6 型电热恒温水浴锅 北京科伟水兴仪器有限公司;KDN－04C型数显消化炉、KDN－04C型凯氏定氮仪上海洪纪仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 谷朊粉理化特性测定 含水量的测定:105℃恒重法［9］;粗蛋白含量的测定:微量凯氏定氮法［10］;灰分含量的测定:灼烧法［11］;粗脂肪含量测定:酸水解法［12］;碳水化合物测定:DNS 比色法［13］。

1.2.2 多肽含量测定 配制质量浓度为10mg/mL的酪蛋白，分别吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 于试管中，用蒸馏水补足到1mL，加4mL双缩脲试剂，于波长540nm处进行比色，以吸光度值为横坐标，酪蛋白浓度为纵坐标，绘制标准曲线。得到线性回归方程为y=0.049x+0.002(R2=0.999)。将待测蛋白吸光度值代入标准曲线，可求出待测蛋白的含量［14］。

取水解液10mL，加入10%的三氯乙酸溶液10mL与之混合反应，放置30min，在3500r/min下离心10min，用双缩脲法测定上清液中可溶性蛋白质浓度，即可计算出多肽的浓度［15］。

1.2.3 DPPH自由基清除率的测定［16－17］取待测液及等体积0.2mmol/L DPPH溶液加入同一具塞试管中，摇匀，30min后用无水乙醇作参比测定其吸光度Ai，同时测定0.2mmol/L DPPH溶液与等体积无水乙醇混合液的吸光度Ac，以及待测液与等体积无水乙醇混合液的吸光度Aj。按照式1计算清除率。

式中:Ac为未加待测液时DPPH溶液的吸光度;Ai为加待测液时DPPH溶液的吸光度;Aj为待测液与无水乙醇混合液的吸光度;测定波长为517nm。

1.2.4 蛋白酶水解小麦面筋蛋白 准确称取定量干燥小麦面筋蛋白，加入去离子水溶解;将蛋白溶液调节至指定pH，分别加入木瓜蛋白酶后恒温水浴反应。反应结束后100℃灭酶活性;测定反应液最终pH，将酶解液在3000r/min离心15min，取上清液，冷藏待测。

1.2.5 正交实验 酶促水解受诸多因素影响，出于对实验的综合考虑及单因素的实验结果，以DPPH自由基清除率为考察指标，选取酶解温度、酶解时间、加酶量、底物量四项作为考察因素，各取三个水平，进行L9(34)正交设计实验，确定木瓜蛋白酶水解小麦面筋蛋白的最佳工艺条件，并对最优条件进行验证实验。

2 结果与讨论

2.1 原料组成分析

对原料基本组成进行分析，具体结果见表2。

表1 因素水平表Table 1 Factor and levels of experiment

表2 谷朊粉基本化学组成Table 2 Basic chemical composition of wheat gluten

从表2测定结果可看出，谷朊粉的蛋白质含量相当高，且营养丰富、价格低廉，是制备抗氧化肽的优良蛋白来源。

2.2 木瓜蛋白酶酶解谷朊粉单因素实验

2.2.1 酶解温度对DPPH·清除率和多肽含量的影响选择底物量5g，酶解时间4h，加酶100U/g，酶解温度分别为 20、30、40、50、60、70、80℃，考察酶解温度对制备谷朊粉蛋白酶解液抗氧化活性肽的影响，结果如图1所示。

图1 酶解温度对DPPH·清除率和多肽含量的影响Fig.1 Effect of temperature on DPPH radical scavenging and peptide content

由图1可看出:温度在20～40℃间，随着酶解温度的升高，越来越接近酶的最适温度，由于温度直接影响酶的活性及结构，酶的活性逐渐增强，对谷朊粉的作用能力也逐渐增强，因此，DPPH自由基清除率及多肽含量增长迅速。40℃时，DPPH自由基清除率达到最高，为90.32%，表明，此时达到酶的最适温度，酶的作用活性最强，对谷朊粉的作用强度最大。当酶解温度超过40℃时，酶解液的DPPH·清除率开始下降，温度超50℃时，多肽含量也开始下降，表明温度过高可能已导致酶活性降低。因此，酶解温度选择为 40℃较为合适，在此条件下清除率达到90.32%，多肽含量为36.43mg/mL。

2.2.2 酶解时间对DPPH·清除率和多肽含量的影响 固定酶解温度为40℃，加酶量125U/g，底物含量5g，分别酶解 1、2、3、4、5、6h，考察酶解时间对谷朊粉酶解液抗氧化能力的影响，结果如图2所示。

图2 酶解时间对DPPH·清除率和多肽含量的影响Fig.2 Effect of time on DPPH redical scavenging and peptide content

由图2可知，酶解1、2h时，谷朊粉酶解液的抗氧化能力显著提高，在2～4h时增加趋于平缓，4h时DPPH·清除率达到最大值为95.25%。4～6h时，抗氧化能力开始下降。而酶解1～6h时，多肽含量一直增加。这表明:1～2h时蛋白酶与底物充分作用，所以反应迅速。2～4h时，酶与底物接触的作用位点已满，从而反应缓慢，4～6h时，由于时间过长，酶解液中的抗氧化活性肽与空气接触，被空气中的氧气氧化，从而又会引起产物结构的变化进而使清除率下降。可见，酶解时间延长虽利于多肽含量增加，但其抗氧化活性4h后开始降低。因此，选择酶解时间为4h。

2.2.3 加酶量对 DPPH·清除率和多肽含量的影响 固定温度为40℃、底物含量5g，时间为4h，加酶量为25、50、75、100、125、150U/g，考察酶解时加酶量对谷朊粉酶解液抗氧化能力的影响，结果如图3所示。

图3 加酶量对DPPH·清除率和多肽含量的影响Fig.3 Effect of enzyme on DPPH radical scavenging and peptide content

由图3可知，随着加酶量的增加，DPPH·清除率和多肽含量逐渐增加，当加酶量达到100U/g时，DPPH·清除率增加缓慢，多肽含量增加迅速。在加酶量达到125U/g时，DPPH自由基清除率最高，为95.58%。之后随着加酶量的提高，谷朊粉酶解物的多肽含量继续增加，DPPH自由基清除率开始下降，考虑可能是因为增加酶用量使得蛋白水解得更为充分，因此总多肽含量增加，但具有抗氧化活性的多肽量降低，导致DPPH自由基清除率下降。因此，选定加酶量为125U/g。

2.2.4 底物浓度对DPPH·清除率和多肽含量的影响固定酶解时间4h，酶解温度40℃，加酶量125U/g，底物量分别为 1、2、3、4、5、6g，考察不同底物量的酶解产物的对DPPH自由基清除率的影响如图4所示。

图4 底物量对DPPH·清除率和多肽含量的影响Fig.4 Effect of substrate concentration on DPPH radical scavenging and peptide content

由图4可知，当底物含量达到5g时，DPPH自由基清除率基本达到最高，为95.88%;当底物量小于5g时，清除率升高显著，表明较低底物量不足以与酶完全反应;当继续增大底物量时，酶解液羟DPPH·清除率呈现降低的趋势。同时随着底物浓度的增大，多肽含量逐渐增大，当底物量达到5g后，其增加趋势逐渐趋于平缓可能是由于当底物浓度达到一定程度时，几乎所有的酶分子都与底物结合，出现“饱和”现象，再增加底物浓度不利于水解，而且还有一定程度的抑制作用。由分析可知:在固定温度40℃、酶解时间4h，加酶量125U/g条件下，当谷朊粉量为5g时，酶解液的DPPH·自由基清除率最高。

2.5 正交实验方差分析结果

根据实验结果，获得实验直观分析表见表3。

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance

根据极差分析结果可知，各因素对小麦面筋蛋白酶解产物DPPH自由基清除率的影响程度由高到低依次为:A＞C＞B＞D，即酶解温度＞加酶量＞酶解时间＞底物量，最优组合为A1B3C3D1，此组合未出现在正交表中。按此优化条件下，DPPH自由基清除率达到96.59%，多肽含量为35.51mg/mL。各因素对小麦面筋蛋白酶解产物多肽含量的影响程度由高到低依次为:A＞D＞C＞B，即酶解温度＞底物量＞加酶量＞酶解时间，最优组合为A1B3C3D3，与正交表中第三组实验一致，此最佳条件下，DPPH自由基清除率达到95.58%，多肽含量为36.43mg/mL。可以看出，两组的最佳温度(40℃)、加酶量(125U/g)及水解时间(4h)都相同，只是底物量有所区别。考虑可能因为随着底物浓度增加，酶分子都与底物结合出现“饱和”，同时，高浓度的底物反而抑制了抗氧化活性的表达。根据标准偏差值，可看出不同实验组合对DPPH自由基清除率影响较大。本实验主要是研究优化抗氧化肽活性肽的制备工艺，同时考虑到经济效益，最终确定最佳组合为A1B3C3D1，即最佳的酶解工艺条件为:温度40℃，底物量3.0g，水解时间4h，加酶量125U/g。

表3 正交实验结果Table 3 The orthogonal experiment results

2.6 验证实验

采用温度40℃，底物量3.0g，水解时间4h，加酶量125U/g的酶解条件与正交实验中较优组进行比较验证，结果见表5。

表5 验证实验结果Table 5 Results of the proven experiment

即最佳的酶解工艺条件为:温度40℃，底物量3.0g，水解时间4h，加酶量125U/g。在此工艺条件下，DPPH自由基清除率达到96.59%，多肽含量为35.51mg/mL。

3 结论

3.1 在木瓜蛋白酶酶解谷朊粉制备抗氧化多肽工艺研究中，通过正交实验得出，对DPPH自由基清除率影响最大的因素是酶解温度，其次是加酶量及酶解时间，底物浓度影响最小，酶解温度及时间(F值＞F临界值)具有显著性。对多肽含量影响最大的因素是酶解温度，其次是底物量及加酶量，酶解时间影响最小，酶解温度(F值＞F临界值)具有显著性。

3.2 通过正交设计实验确定木瓜蛋白酶的最适反应条件为:温度40℃，底物量3.0g，水解时间4h，加酶量125U/g。在此工艺条件下，结合验证实验结果，DPPH自由基清除率可达96.59%，多肽含量为35.51mg/mL。说明木瓜蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的酶解产物具有较强的抗氧化活性。

3.3 利用木瓜蛋白酶对谷朊粉进行酶解制备抗氧化多肽，对于多肽的组成和结构有待进一步研究。

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