普洱茶对酒精性脂肪肝大鼠抗氧化应激作用的研究

王 蕊，肖 蓉，刘家奇，杨兰兰，刘文文，施瀚超，侯 艳，*

(1.云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明650201;2.云南农业大学龙润普洱茶学院，云南昆明650201;3.云南省昆明市动物疫病预防控制中心，云南昆明650000;4.云南农业大学动物科技学院，云南昆明650201)

近年来，酒精已成为病毒性肝炎后导致肝损害 的第二大病因［1］。现代研究证实，普洱茶具有降脂、减肥、降压、抗动脉硬化;防癌、抗癌;养胃、护胃;健牙护齿;消炎、杀菌、治痢;抗衰老等作用［2－6］，普洱茶以其广泛的生物学效应，尤其是抗氧化效应和降血脂、降血糖效应，对于酒精性脂肪肝的防治显示出诱人的应用前景。细胞色素P450，是肝脏代谢最主要的酶系之一，其中细胞色素P4502E1(CYP2E1)与酒精代谢密切相关，CYP2E1是细胞色素P450的乙醇诱导形式，它可催化乙醇产生过氧化物，引发脂质过氧化，在酒精性肝损伤发病机制中起重要作用［7］，细胞色素P4502E1是主要在肝脏表达的细胞色素P450重要的亚型，国内对酒精性肝损伤的研究主要集中在氧化损伤方面，而参与氧化代谢的重要代谢酶亚型CYP2E1在酒精引起的酒精性肝损伤中的变化及作用环节尚未明确。胰岛素样生长因子1(IGF－1)具有胰岛素样作用，对糖、脂代谢的作用与胰岛素有类似之处，IGF－1能改善肝功能，减轻肝脏氧化损伤［8－9］，动物试验提示低剂量 IGF－1 有抗肝纤维化作用［10］，在一定程度上 IGF－1水平可以反映肝脏细胞的活性。肝脏是合成IGF－1的主要场所，如果肝细胞受损则IGF－1表达降低，已有报道IGF－I在肝硬化患者中的含量明显下降，但它与酒精性脂肪肝的关系鲜见报道，鉴于此，本试验选取与预防肝细胞氧化损伤关系密切的CYP2E1、IGF－1为分子靶点，同时测定肝组织中的抗氧化指标、血清血脂指标及胰岛素水平，探索普洱茶对酒精性肝组织损伤的分子机制及普洱茶对酒精性脂肪肝大鼠抗氧化应激作用的影响，为普洱茶作为防治肝脏疾病的药物原料或保健食品的开发研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

龙润普洱茶熟茶(2007年10月) 云南云县天龙生态茶叶有限责任公司生产(产品标准号:DB53/103－2007);版纳普洱熟茶(2007年7月) 云南省农业科学院茶叶研究所，西双版纳普洱茶研究院(产品标准代号:DB53/103);帕卡普洱熟茶(2007年5月) 云南省思茅茶树良种场，中国普洱茶研究院(产品标准代码:DB53/103)，将上述茶样按1∶1∶1等量混合制成受试茶样;药物组药品 市售某保肝药物;活性氧(ROS)、胰岛素(INS)试剂盒 北京奇松生物科技有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH－PX)、丙二醛(MDA)、甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(FFA)试剂盒 南京建成生物工程研究所;SPF级Wistar雄性大鼠(180～220g) 由北京维通利华试验动物技术有限公司提供(批号:SCXK(京)2012－0001);动物饲料 由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物饲料营养成分及能量组成如表1。

L－3280半自动生化分析仪 上海科华试验系统有限公司生产;7900HT荧光定量PCR仪 新加坡制造;Epppendorf－4910单道微量可调移液器 德国Epppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 茶汤制备方法 普洱茶(熟茶)磨碎后制备茶汤，制备方法参照文献［5］。提取的茶汤终浓度为1g/mL，灭菌后置于4℃冰箱保存待用。

1.2.2 动物分组与处理 根据所评价的功能性试验动物要求，选用外形符合健康标准，体重在180～220g之间的SPF级Wistar雄性大鼠为试验对象。观察喂养3d后，剔除不合格鼠，按体重随机分为阴性对照组、阳性对照组、药物组，普洱茶(熟茶)低、中、高剂量组，每组10只，共60只。阴性对照组每天饲喂阴性对照组液体饲料，其他各组大鼠均饲喂试验组饲料，每天定时经口灌胃受试样品。普洱茶组给予不同剂量普洱熟茶(低、中、高剂量分别为人体推荐摄入量的5、10、20 倍，即 0.5、1.0、2.0g/kg·bw)，药物组灌胃药品(0.15g/kg·bw)［11］，一次经口灌胃 2mL/d，阴性对照组和阳性对照组均灌胃等体积的蒸馏水。

表1 动物饲料营养成分及能量组成表Table 1 Nutritional composition and energr of feed

1.2.3 动物饲养管理 大鼠同室单笼饲养，采用液体饲料饲喂，每天晚上定时更换饲料并记录大鼠摄食量，环境温度控制在(20±2)℃，湿度45%～60%。笼具、垫料舒适、卫生、无毒、安全，饲养房间定时用消毒剂消毒，房间定时通风，使其保持一个良好的饲养环境。

1.2.4 测定指标与方法 试验第60d，大鼠12h禁食不禁水，股动脉采血，分离血清，测定血清中 TG、FFA、INS水平，牺牲大鼠后，摘取肝组织，制备10%的肝脏匀浆，测定肝组织中ROS、SOD、GSH－Px活性及MDA含量;检测方法参照试剂盒说明书进行。

RNA提取和 RT－PCR:肝脏总 RNA的提取和cDNA的合成分别用 TRIZOL和TAKARA(Code:DRR047A)试剂盒按试剂盒标准步骤操作。PCR引物序列:R－CYP2E1:CAAGGCTGTCAAGGAGG TGCTACTG，GCTTAGGGAAAACCTCCGCACATCC;

R－IGF－1:AGCGCCACACTGACATGCCC，GGATCTTGCGGTGACGTGGC;

内参照 Gapdh:GGGCTCTCTGCTCCTCCCTGT，AACCAGGCGTCCGATACGGC。

1.2.5 数据统计方法 采用SPSS17.0软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 普洱茶对酒精性脂肪肝大鼠体重的影响

表2显示，与阴性对照组相比，阳性对照组大鼠体重和体重净增值显著下降(p＜0.01)，与阳性对照组相比，普洱茶高剂量组大鼠体重和体重净增值显著下降(p＜0.05，p＜0.01)。

表2 普洱茶对Wistar大鼠体重的影响Table 2 The influence of Pu－erh tea on the body weight in wistar rats

表3 普洱茶对大鼠肝组织GSH－PX、ROS|、SOD活性、MDA含量的影响Table 3 The influence of fermented Pu－erh tea on liver tissue levels of GSH－Px、SOD、ROS and MDA in wistar rats

表4 普洱茶对大鼠血清INS活性、FFA、TG含量的影响Table 4 The influence of Fermented Pu－erh tea on serum levels of INS、FFA、TG in wistar rats

2.2 普洱茶对酒精性脂肪肝大鼠肝组织GSH－PX、ROS、SOD活性、MDA含量的影响

表3显示，与阴性对照组相比，阳性对照组大鼠肝组织GSH－PX活性显著下降(p＜0.01);SOD活性有所下降，但差异不显著(p＞0.05);ROS活性、MDA含量显著升高(p＜0.05)。与阳性对照组相比，普洱茶高剂量组和药物组大鼠肝组织GSH－PX活力、中、高剂量组大鼠肝组织SOD活性显著升高(p＜0.05，p＜0.01);普洱茶中、高剂量组和药物组大鼠肝组织ROS活性、高剂量组大鼠肝组织MDA含量显著下降(p＜0.05，p＜0.01)。

2.3 普洱茶对大鼠血清INS活性、FFA、TG含量含量的影响

表4显示，与阴性对照组相比，阳性对照组血清INS水平和FFA、TG含量显著上升(p＜0.01)。与阳性对照组相比，普洱茶低、中、高剂量组及药物组大鼠血清 INS活力、TG含量显著下降(p＜0.05，p＜0.01);普洱茶中、高剂量组与药物组大鼠血清FFA含量显著下降(p＜0.01)。

2.4 普洱茶对酒精性脂肪肝大鼠肝组织CYP2E1、IGF－1基因表达的影响

表5显示，与阴性对照组相比，阳性对照组大鼠肝组织CYP2E1基因表达量上升，但差异不显著(p＞0.05)，IGF－1基因表达显著下降(p＜0.05)。与阳性对照组相比，普洱茶高剂量组CYP2E1基因表达量显著下降(p＜0.05)。IGF－1基因表达显著上升(p＜0.05)。

表5 普洱茶对酒精性脂肪肝大鼠肝组织CYP2E1及IGF－1基因表达的影响Table 5 The influence of Fermented Pu－erh tea on Gene expression quantity of CYP2E1 and IGF－1 in rats with alcoholic fatty liver

3 讨论

3.1 普洱茶对酒精性脂肪肝大鼠肝组织CYP2E1基因表达的影响

细胞色素P450，是一组相对非特异性酶，广泛存在于机体内，但主要存在于肝细胞微粒体上，是肝脏代谢最主要的酶系之一，是参与药物代谢及身体其他外来物质代谢作用重要的酶。其中细胞色素P4502E1(CYP2E1)与酒精代谢密切相关，CYP2E1是细胞色素P450的乙醇诱导形式，它在非乙醇脱氢酶氧化途径中起重要作用，为酒精性肝病的主要发病机制［12］。CYP2E1在酒精性肝病的发病机制中主要参与脂质过氧化反应，与ROS生成有关。酒精在肝细胞内通过细胞色素CYP2E1并在铁离子参与下的氧化作用，会产生过多的ROS，如·OH－、O2－·、H2O2等自由基，这些活性氧自由基可激活磷脂酶及脂质过氧化反应，降低膜磷脂，改变其通透性和流动性，从而改变与膜结合的酶、受体和离子通道的微环境，影响其功能，还可以刺激肝星状细胞分泌胶原，最终导致肝纤维化的产生［13］。此外，乙醇的摄入可诱导CYP2E1基因的表达，CYP2E1具有很强的氧化活性，能将乙醇氧化生成乙醛，产生大量活性氧中间产物并激活Kupffer细胞释放炎症因子，使ROS增多;随着CYP2E1表达的增强，体内清除ROS自由基的SOD、GSH－PX含量均显著下降。由于脂质过氧化反应的增强而抗氧化能力的下降，导致ROS的生成增多，进一步促进脂质过氧化反应，使MDA生成增加，最终导致肝细胞结构与功能的损害。另外还发现，自由基可以在肝细胞膜上与CYP2E1结合引起抗体依赖的细胞毒作用，使肝细胞损伤，导致酒精性肝病的病理变化。

本试验研究结果显示:RT－PCR方法测定CYP2E1mRNA表达说明，与阴性对照组比较，阳性对照组大鼠肝组织中CYP2E1基因表达上升，ROS活性、MDA含量显著升高，肝组织中SOD和GSH－PX活力显著下降，提示摄入酒精后会诱导CYP2E1表达上升，进而导致ROS大量生成，从而加重酒精性脂肪肝大鼠体内的脂质过氧化反应，由此可知，CYP2E1基因的高表达与脂质过氧化是脂肪肝发病过程中不可忽略的重要因素。给予普洱茶和受试药物后，各试验组大鼠肝组织CYP2E1基因表达、ROS活性、MDA含量均下降，SOD和GSH－PX活力显著升高，提示普洱茶可有效抑制酒精性脂肪肝大鼠肝组织CYP2E1基因表达，但其具体的作用机制还需进一步研究。

通过对抗氧化指标的检测提示:普洱茶可能通过提高清除自由基的SOD和GSH－PX的活性，进一步提高机体抗氧化的能力，进而增强了脂质代谢的能力，减缓了脂毒性，提高了机体防御和消除自由基的能力，降低机体脂质过氧化的程度，从而预防和减轻了酒精性脂肪肝的发生或发展。这可能与普洱茶含有多种生物活性成分有关。普洱茶中含有的茶多酚和茶多糖，具有结合自由基，抑制细胞色素参与亲电子代谢物的形成，阻断或减慢氧化应激和炎症反应，防止机体脂质过氧化等作用［14］

3.2 普洱茶对酒精性脂肪肝大鼠肝组织IGF－1基因表达的影响

IGF－l是由70个氨基酸组成的单链多肽。主要由肝细胞分泌，它具有广泛的生理作用，在细胞的生长、分化及代谢的调节有着重要的作用，IGF－1和胰岛素有50%的序列相同，血液中的 IGF－l主要来源于肝脏的生物合成，在代谢方面IGF－1具有胰岛素样作用［15］，其中类似胰岛素的代谢效应主要表现为:促进组织摄取葡萄糖，刺激糖原异生和糖酵解;促进糖原合成，促进蛋白质和脂肪合成，抑制蛋白质和脂肪分解，减少血液FFA和氨基酸的浓度。有研究表明IGF－1的表达能有效降低糖尿病动物的血糖［16］;IGF－1在肝组织［17］对胰岛素抵抗有保护作用，能改善肝功能，减轻肝脏氧化损伤［8－9］。

本研究试图探讨IGF－l对酒精性脂肪肝的影响，从而为临床治疗酒精性脂肪肝提供依据，结果表明，酒精性脂肪肝大鼠肝组织IGF－l基因表达显著下降，考虑机制如下:IGF－l主要在肝脏合成，其合成受生长激素(GH)的控制，称为 GH－IGF－l轴，GH 与GH受体结合后在肝内促进IGF－l的基因转录［18］。当肝脏严重受损时，肝细胞合成GH受体能力降低，肝细胞GH受体表达减少，从而使IGF－1表达减少。此外酒精性脂肪肝大鼠体内血清FFA、TG、INS水平显著上升，提示酒精性脂肪肝大鼠体内脂质代谢紊乱，胰岛素水平异常。有研究表明，血循环中FFA浓度过高以及非脂肪细胞(主要是肌细胞、肝细胞、胰岛β细胞)内脂质含量过多，可通过各种有关途径导致胰岛素抵抗的发生，以及引起胰岛β细胞性凋亡和分泌INS功能缺陷［19］，导致INS异常，本试验结果也证明了这一点。胰岛素抵抗在脂肪肝的发生发展中起重要作用［20－21］。有研究表明，外周胰岛素抵抗可能使抑制激素敏感性脂肪酶的活性下降，外周脂肪组织分解增加，FFA水平升高，而FFA水平升高可加剧患者的胰岛素抵抗［22］，这样INS、FFA之间形成了一个恶性循环，加重肝细胞损伤。给予普洱茶后，IGF－l基因表达显著上升，各试验组 INS水平和FFA、TG含量显著下降，提示，普洱茶可有效促进IGF－1基因的表达，大量的IGF－1有促使肝细胞增殖，加强肝脏的合成和代谢功能，从而促进受损肝细胞恢复的作用。试验结果也证实，随着IGF－1基因表达量上升，各试验组FFA、TG含量显著下降，这可能与IGF－1能加强代谢功能、改善肝功能、减轻肝脏氧化损伤、有效改善胰岛素抵抗有关。

4 结论

综上所述，本批次普洱茶(熟茶)在本试验条件下，可有效抑制酒精性脂肪肝大鼠体内CYP2E1基因的表达，促进IGF－1基因表达，进而改善大鼠体内脂质过氧化损伤、有效降低大鼠血脂水平，改善胰岛素抵抗，进而起到了抗氧化应激的作用，有效的预防了酒精性脂肪肝的发生和发展。

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