固相萃取-高效液相色谱-荧光检测方便面中的苯并（a）芘

史海良

（国家食品质量安全监督检验中心，北京100094）

苯并（a）芘（BaP），是一种常见的高活性间接致癌物[1]。苯并（a）芘（BaP）通过食物链在鱼类、植物和软体动物中发生生物蓄积，造成食物污染[2]。方便面是指通过对面条进行蒸煮、油炸等工艺制得，再佐以油酱、菜肉、粉料等调料包，经过简单冲泡即可食用的即食食品。方便面原料受到污染或者不适当的油炸可能使方便面中的BaP含量升高[3]，2012年10月知名方便面品牌农心在韩国生产的6款方便面被卷入致癌物苯并（a）芘风波，消息引起各界高度关注。在食品苯并（a）芘的检测中，根据检测对象、富集提取方式的不同，使用的分析方法也不相同，主要有薄层层析法、荧光分光光度法、气相色谱法、气相色谱质谱法、高效液相色谱紫外法、高效液相色谱荧光法[4-9]，其中荧光法灵敏度高，重现性好，是较常用的方法[7-9]。目前，我国检测食品中苯并（a）芘的标准方法主要有GB/T5009.27，GB/T22509，NY/T1666，SC/T3041等，这些方法通常存在样品处理复杂、耗费试剂量大、检测周期长等局限性。本实验根据方便面中不同的食品材质，分别对方便面中的油酱料包，粉料、菜肉包和面饼采取不同的预处理方案，再用高效液相色谱荧光检测法进行检测，旨在建立一种试剂用量少、分离效果好、简便快速的方便面中苯并（a）芘的检测方法。本文采用HiCapt-Benzo苯并（a）芘专用固相萃取柱对基质较为复杂的方便面样品进行净化处理，有效排除基质干扰，再用高效液相色谱—荧光检测器（HPLC-FLD）测定，灵敏度高，重现性好，有利于方便面中苯并（a）芘的准确快速的定性定量分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苯并（a）芘标准品 中国计量科学研究院标物中心；HiCapt-Benzo苯并（a）芘专用柱 维泰克科技有限公司；乙腈 色谱纯；水 超纯水，正己烷，丙酮，乙酸乙酯，异丙醇 分析纯。

Agilent1200高效液相色谱仪配荧光检测器、Agilent SB-C18（4.6×250mm，5μm）色谱柱；TGL-16M离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；高速分散机 IKA T18；涡旋混合器 Vortex-Genie 2；加压固相萃取装置 美国J2 scientific公司；N-EVAP111氮吹仪 美国仪器集团；BP112s天平 赛多利斯仪器系统有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 试剂处理 正己烷、丙酮、乙酸乙酯、异丙醇分别进行重蒸，然后分别量取重蒸后的正己烷41.4mL、丙酮8mL和乙酸乙酯0.6mL混合后转移入旋转蒸发瓶中蒸发至近干，然后再用氮气吹干，最后用0.2mL重蒸后异丙醇溶解，在液相荧光条件下检不出苯并（a）芘为合格（注：以下实验所使用试剂皆为重蒸处理后试剂，乙腈和水除外）。

1.2.2 提取流程

1.2.2.1 油酱料包预处理 40℃水浴溶解酱料包中的油脂，然后准确称取0.4g（精确到0.0001g）左右样品置于5mL试管中，然后用后正己烷2mL涡旋溶解，等待净化。

1.2.2.2 粉料包，菜肉包，面饼预处理 准确称取初步粉碎的样品2g（精确到0.01g）左右置于50mL离心管中，加入2g无水硫酸钠，加入15mL正己烷，匀浆处理2min，超声提取5min，6000r/min离心2min，收集上清液置于50mL旋转蒸发瓶中，然后再加入10mL正己烷溶解残渣，重复上述过程两次，合并正己烷提取液，用旋转蒸发器40℃浓缩到1mL左右，转移浓缩液到5mL试管中，用0.5mL正己烷淋洗蒸发瓶，合并溶液，然后用正己烷定容到2mL，等待净化。

1.2.3 净化 在HiCapt-Benzo柱中依次加入5mL丙酮，2mL正己烷活化。在柱中正己烷液面为2mm时上样，将1.2.2.1和1.2.2.2得到的待净化液加入HiCapt-Benzo柱中，此过程注意不要使柱干涸，再用200μL正己烷淋洗样品管，一并加入SPE柱中，流出液弃去。待上样液完全流出后，用3mL的乙酸乙酯∶正己烷=1∶4（V/V）溶液淋洗，淋洗液弃去，将SPE柱吹干。然后用3mL丙酮解吸，收集解吸液。解吸液40℃下用氮气吹干，加入异丙醇200μL溶解并定容，待液相色谱荧光检测。

1.2.4 液相色谱荧光检测 检测条件：色谱柱：Agilent SB-C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈∶水=88∶12（V/V）；流速：1.0mL；柱温：30℃；进样量：20μL；荧光检测器：激发波长384nm，发射波长406nm。

2 结果与讨论

2.1 试剂处理的效果

在富含多环芳烃的石油和煤工业产品中不可避免的存在苯并（a）芘（图1），检测苯并（a）芘中使用的大部分试剂都是石油和煤工业的产品，如何清除试剂中苯并（a）芘对检测的干扰是一个必须要解决的问题，否则就会造成假阳性、定量不准确、重复性差等结果的出现。苯并（a）芘熔点179℃，沸点475℃，因此在重蒸馏的情况下可以完全的去除试剂中的干扰（图2），尽可能的保证结果准确可信。

图1 未重蒸试剂色谱图Fig.1 Chromatogram of not redistillation reagents

图2 重蒸后试剂色谱图Fig.2 Chromatogram of redistillation reagents

2.2 提取溶剂的提取效率

实验中考察了石油醚、无水乙醚、正己烷和环己烷作为提取剂的提取效果（表1）。加标回收率实验发现正己烷和环己烷提取效果最好，考虑到和净化步骤保持一致尽量减少使用试剂种类，减少试剂处理的工作量，降低试剂造成污染的可能性等因素，最终选用正己烷作为苯并（a）芘提取试剂。

表1 提取试剂的提取效果Table 1 Results of extraction reagents

2.3 净化条件的选定

苯并（a）芘的检测中广泛使用的是中性氧化铝柱、弗罗里硅土固相萃取柱和C18固相萃取柱[9]。中性氧化铝使用前处理耗时较长，对活性的控制较难掌握，因此重现性较差；弗罗里硅土和C18固相萃取小柱，样品溶解上样后，用非极性试剂洗脱，也能取得良好的净化效果和回收率。但是这两种小柱在净化过程中引入其他不同于提取溶剂的试剂，使试剂的处理更加复杂化，并有可能影响检测结果。所以选用了HiCapt-Benzo苯并（a）芘专用柱，在有效去除油脂中的中性脂肪和维生素等基质干扰的同时，尽量简化净化方法使其简单、快速，使用溶剂与提取溶剂相一致，且回收率稳定、重现性良好。

2.4 液相色谱仪与荧光检测器的设定

实验参考GB/T22509的流动相组成，比较了不同比例的乙腈与水作流动相的效果，实验发现，乙腈的比例对目标物出峰时间影响比较大，乙腈比例较大时，洗脱能力较强，可以缩短苯并（a）芘的保留时间，但此时样品中其他杂质会发生重叠；减小乙腈比例可以改善样品溶液中各个色谱峰的分离度，但苯并（a）芘的保留时间延长，操作费时。在本文实验条件下，当乙腈∶水=88∶12（V/V），流速为1.0mL/min，柱温30℃，荧光激发波长384nm，发射波长406nm时，苯并（a）芘出峰时间合适，峰形较好并能与基体杂质分开（图3、图4）。

图3 苯并（a）芘（10.0μg/L）标准样品色谱图Fig.3 Chromatogram of the Benzo（a）pyrene（10.0μg/L）standard solution

图4 苯并（a）芘阳性样品色谱图Fig.4 Chromatogram of the Benzo（a）pyrene in positive sample

2.5 方法的线性范围、定量限、回收率和精密度

在1.0～200μg/L浓度范围内，分别配制苯并（a）芘浓度为1.0、5.0、20、50、100、200μg/L的标准溶液，以峰面积（Y）与苯并（a）芘浓度（X，μg/L）绘制标准工作曲线。结果表明，在1.0～200μg/L浓度范围内，苯并（a）芘呈良好线性关系，线性方程Y=2.582X+1.410，相关系数（R2）为0.9998，测定低限（S/N≥10）油料包为0.5μg/kg，粉料包和面饼0.1μg/kg。

选择空白方便面样品（图5），在优化后的实验条件下，对方便面样品进行加标回收率实验，苯并（a）芘的加标浓度选为高中低三个浓度分别为1.0、5、20μg/kg，每个水平进行6次平行实验，各加标浓度的回收率和精密度见表2。结果表明，添加浓度1.0～20μg/kg时，回收率范围78.1%～96.7%，相对标准偏差0.97%～6.23%，符合苯并（a）芘检测的要求。

表2 空白方便面中样品中苯并（a）芘加标回收率和和相对标准偏差（n=6）Table 2 Recoveries and RSD of Benzo（a）pyrene in the instant noodles（n=6）

图5 苯并（a）芘空白样品图Fig.5 Chromatogram of the Benzo（a）pyrene in blank sample

3 结论与讨论

方便面中的苯并（a）芘来源有两个可能的途径：一是原料受到污染，主要是调味油酱、调味粉料等容易带入；二是在生产过程中不适当的油炸有可能使面饼中的苯并（a）芘含量升高；针对动植物油脂和肉类的苯并（a）芘检验方法比较多，主要有皂化法、固相萃取法、液液萃取法等[10]，针对面条等粮食制品中的苯并（a）芘检验方法较少主要是液液萃取法[5]，本文同时针对方便面中苯并芘不同的来源采用不同的提取方法，然后采用相同的净化条件既充分保证提取的效率，又兼顾了实验室工作的效率。苯并（a）芘检测的难点在于有效的排除干扰，干扰包括使用试剂带入和样品基质中固有两部分，试剂处理是苯并（a）芘检测排除假阳性的一个关键性步骤，在一些试剂中曾发现苯并（a）芘含量甚至超过食品标准限量的现象，同时样品前处理的结果将直接影响检测结果的准确性和可靠性。本研究中所有试剂都经过处理，并且检验合格，保证实验所使用试剂不会对检验结果形成干扰和影响；样品经匀浆、超声萃取、离心分离上清，再经苯并（a）芘专用固相萃取柱净化，有效排除了中性脂肪和维生素等基质因素对目标峰的干扰，得到的色谱图背景干净，色谱峰形好。该法样品前处理比较简单，分离效果好，且准确性和重复性好，满足于方便面中苯并（a）芘含量的测定，各项技术指标均符合检测要求。

[1]李永红，金银龙.苯并（a）芘致癌机制研究新进展[J].医学研究杂志，2011，40（8）：152-154.

[2]李永和.3-4苯并芘（BaP）对粮食及食品的污染[J].粮食科技与经济，1997（4）：37-38.

[3]赵月兰，秦建华.苯并芘对动物性食品的污染与检测[J].中国动物检疫，1996，3（2）：15.

[4]李进伟，王兴国，金青哲.食用油中苯并（a）芘的来源检测和控制[J].中国油脂，2011，36（6）：7-11.

[5]王浩，杨红梅.高效液相色谱法测定粮食中苯并芘残留的研究[J].粮油食品科技，2007，15（1）：53-54.

[6]李先国，阎国芳，周晓，等.固相萃取—高效液相色谱—荧光检测法测定海水中的多环芳烃[J].中国海洋大学学报，2009，39（5）：1087-1092

[7]李春篱，梁春群，陈同欢，等.荧光光度法测定食用油中的苯并（a）芘[J].化工技术与开发，2008，37（2）：37-42.

[8]柯华，林捷，郑申西.凝胶净化-高效液相色谱法测定油脂中苯并（a）芘[J].中国卫生检杂志，2010，20（2）：265-266.

[9]杨燕，付亚群，吴晓萌，等.固相萃取-高效液相色谱法分析食用油中的苯并芘[J].山东大学学报：医学版，2012，50（8）：124-127.

[10]俞晔，金青哲，刘海珍，等.食用油脂中多环芳烃检测的前处理技术研究进展[J].中国油脂，2011，36（7）：1-4.