金莲花中荭草苷和牡荆苷对人食管癌细胞生长及凋亡的影响

朱登祥 安 芳 王书华

(河北北方学院药学系，河北 张家口 075000)

金莲花的现代药理研究表明，金莲花总黄酮是其有效成分，前期研究发现，金莲花总黄酮具有抗肿瘤作用〔1～3〕，目前在临床上主要用于抗菌抗病毒的治疗。金莲花黄酮单体荭草苷和牡荆苷具有抗氧化作用〔4，5〕。荭草苷和牡荆苷在金莲花中含量较高〔6〕，与抗肿瘤作用较强的木犀草素及芹菜素〔7〕具有相似的化学结构。本研究拟进一步观察荭草苷和牡荆苷对人食管癌EC-109细胞的作用。

1 材料与方法

1.1 仪器 全自动荧光酶标仪(Spectra Max，美国分子仪器有限公司);凝胶成像系统(BioSpectrumAC system，美国UVP公司);流式细胞仪(FCM，FACS-Aria美国BD公司);ECLIPSE Ti-U荧光倒置显微镜(日本Nikon公司);3319型CO2培养箱(美国Forma公司);电子天平ME235S(德国);SW-CJ-2FD型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);TDL-40B型离心机(上海安亭科学仪器厂);DK-8A型电热恒温水浴槽(上海精宏实验设备有限公司);DH4000A型电热恒温箱(泰特)

1.2 药品与试剂 EC-109细胞(购自北京肿瘤研究所遗传室，后经河北北方学院实验中心细胞室传代冻存);细胞培养基RPMI 1640(美国Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);CCK-8试剂盒(上海玛芝佳公司);细胞凋亡Hoechst染色试剂盒(晶美生物工程有限公司);Annexin V-FITC试剂盒(碧云天试剂公司);胰蛋白酶(华北制药集团);二甲亚砜(DMSO)(北京化学试剂厂);琼脂糖、100 bp DNA marker(北京六和同公司)。

1.3 细胞培养与传代 培养液用前加入10%FCS、100 U/ml庆大霉素，用碳酸氢钠调pH值7.2～7.4。消化液为0.25%胰酶+0.02EDTA(1∶3)混合。人食管癌EC-109细胞于37℃饱和湿度、5%CO2条件下，采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基进行培养，细胞培养24 h后，在倒置显微镜下观察细胞生长情况，细胞贴壁呈梭状生长、透亮，表明细胞生长良好，细胞占瓶底约80%左右时即可进行传代培养。

1.4 实验分组 实验分空白组(加等量的培养液);溶剂对照组(加入含DMSO的培养液，使DMSO终浓度为0.2%，荭草苷和牡荆苷不溶于水，DMSO为助溶剂);药物组(荭草苷和牡荆苷终浓度分别为5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μmol/L)。

1.5 细胞生长增殖抑制率检测 采用细胞计数试剂盒CCK-8法。以0.22μm滤器除菌储存备用，用时以RPMI1640培养液逐级稀释。取对数生长期的EC-109细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化后，细胞计数，调整细胞密度，取100μl单细胞悬液加入96孔板，使每孔细胞1×105个，待细胞贴壁后，轻轻吸去上清，按实验分组加入药物。每组各设5个复孔，加入药物后，培养至24、48、72 h后，每孔加入10 μl CCK-8 液，继续培养4 h，采用全自动酶联免疫检测仪在450 nm波长测定吸光度值，计算药物对癌细胞的平均抑制率。

1.6 Hoechest33258染色观察细胞核形态 EC-109细胞以每孔900μl(含5×103细胞)接种于24孔培养板。培养6 h，细胞贴壁后加入100μl不同处理因素，使荭草苷、牡荆苷终浓度为5.0、20.0、80.0μmol/L。空白组不含处理因素。培养48 h后Hoechst33258染色，以紫外光340 nm波长激发，荧光显微镜下观察、拍照。

1.7 琼脂糖凝胶电泳检测DNA Ladder 调整细胞密度为1×106/ml接种于20 ml的培养瓶(2.5 ml/瓶)，待细胞贴壁后，加入药物。荭草苷、牡荆苷终浓度为5.0、20.0、80.0μmol/L，设空白对照组。培养48 h后，收集细胞，用PBS洗涤3次，最后1次移入1.5 ml EP管中，加裂解液615μl，70℃水浴振荡15 min，重复2次，离心取上清液500μl加1 000μl的无水乙醇使DNA析出，离心后用20μl TE缓冲液(pH7.4)溶解DNA。按照试剂盒的操作步骤进行琼脂糖凝胶电泳，电泳前用RNA酶(10 g/L)消化30 min，2%琼脂糖凝胶电泳60 min，采用凝胶成像系统观察并拍照。

1.8 流式细胞仪检测细胞早期凋亡 实验分组及药物作用时间同1.7，每组设置5个平行样。收集对照组及不同浓度药物组作用的EC-109细胞，每组细胞计数为1×106个，离心，弃上清，用冷PBS洗涤2次，按照流式试剂盒的说明分别加入185μl缓冲液，10μl Annexin V和5μl PI，混匀避光20 min，离心后弃去上清，再加入冷PBS洗涤1次，用400μl PBS悬起细胞，用流式细胞仪(FACS-Aria)检测细胞早期凋亡率。

2 结果

2.1 荭草苷和牡荆苷对EC-109细胞生长增殖的抑制作用DMSO对细胞活性及增殖几乎没有影响，最大抑制率没有超过1%，后面实验不再设试剂对照组。实验结果表明，同一时相，不同浓度荭草苷和牡荆苷均对EC-109细胞生长增殖抑制率随着用药浓度的增高而增高(P＜0.05)，不同时相，同一浓度荭草苷和牡荆苷均对EC-109细胞抑制率随时间延长而增加(P＜0.05)。在不同时相，相同浓度的荭草苷对EC-109细胞生长增殖抑制率均高于同浓度的牡荆苷，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 荭草苷和牡荆苷对EC-109细胞生长增殖抑制作用，n=5，%)

表1 荭草苷和牡荆苷对EC-109细胞生长增殖抑制作用，n=5，%)

与同时点下一浓度组比较:1)P＜0.05;与同浓度下一时点比较:2)P＜0.05，与同浓度同时点牡荆苷比较:3)P＜0.05，下表同

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2.2 Hoechest33258荧光标记NDA细胞核形态观察 细胞核形态观察，空白对照组细胞核大小较均一，呈圆形或椭圆形，染色质分布均匀，在紫外线下呈均一的蓝色荧光，可见处于分裂期的细胞。经荭草苷、牡荆苷处理的细胞出现典型的凋亡形态学改变，即胞体缩小，核染色质染色明亮，出现波纹样折缝状，至核浓缩、分叶、边集、核染色质碎裂。随着药物浓度增大，凋亡细胞数逐渐增多。相同浓度的荭草苷作用强于牡荆苷，见图1、图 2。

2.3 琼脂糖凝胶电泳检测结果 空白对照组没有出现梯形DNA条带，而荭草苷和牡荆苷80.0μmol/L组，出现明显条带20.0μmol/L、5.0μmol/L药物组的条带模糊、变暗，但也有较明显的效果，相同浓度的荭草苷比牡荆苷的DNA带稍亮一些，但差异不很明显。见图3。

2.4 FCM检测细胞凋亡率 AnnexinⅤ-FITC/PI双标法检测结果显示，不同浓度荭草苷和牡荆苷均可诱导EC-109细胞凋亡，其凋亡率随浓度的增大而增加。不同浓度荭草苷之间以及不同浓度牡荆苷之间凋亡率相比较均有显著性差异(P＜0.05);较对照组细胞凋亡率显著升高(P＜0.01)。80.0μmol/L荭草苷诱导EC-109细胞凋亡率为28.03%而同浓度牡荆苷为12.38%(P＜0.05)。见表2。

表2 不同浓度荭草苷和牡荆苷对EC-109细胞凋亡的影响，n=3，%)

表2 不同浓度荭草苷和牡荆苷对EC-109细胞凋亡的影响，n=3，%)

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3 讨论

本研究提示，理想的药物作用浓度应该在5.0～80.0μmol/L之间，癌细胞生长增殖被抑制，若引起早期凋亡，在48 h检验效果较好。所以后面的3个检验细胞凋亡的实验，药物作用时间定在48 h。等浓度的荭草苷对EC-109细胞抑制率要明显高于牡荆苷，近乎2倍，这可能与荭草苷化学结构中B环上3'、4'位置上有2个邻位羟基，而牡荆苷化学结构中B环上4'位置上只有1 羟基有关〔8〕。

在细胞早期凋亡发生时，细胞核内NDA可控制降解，形成不同长度的核酸片段，这和细胞坏死，DNA降解不同，所以DNA条带的出现，意味着凋亡的发生。本研究提示，荭草苷和牡荆苷对EC-109细胞诱导凋亡效应机制可能是触发癌细胞凋亡，最终导致DNA可控裂解，细胞缢缩，在体外培养情况下，最终细胞死亡。综上分析，荭草苷和牡荆苷对EC-109细胞生长增殖有明显抑制作用，并能够诱导癌细胞凋亡的发生。相同浓度荭草苷作用强于牡荆苷。

1 孙 黎，罗 强，张 力，等.金莲花黄酮对A549细胞生长及凋亡的影响〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(1):82-3.

2 孙 黎，刘 芳，刘 华，等.金莲花黄酮对人体乳腺癌细胞作用的研究〔J〕.中国老年学杂志，2009;29(5):1098-9.

3 孙 黎，程建贞，罗 强，等.金莲花黄酮对 K562、Hele、Ec-109、NC1-H446细胞增殖的影响〔J〕.郑州大学学报(医学版)，2009;44(5):981-3.

4 颜 娟，胡海娜，田嘉铭，等.金莲花中总黄酮抗氧作用研究〔J〕.时珍国医国药，2010;21(2):386-7.

5 杨国栋，饶 娜，田嘉铭，等.金莲花中荭草苷和牡荆苷的抗氧作用研究〔J〕.时珍国医国药，2011;22(9):2172-3.

6 曲彩虹，颜 娟，田嘉铭，等.HPLC测定金莲花中三种黄酮苷的含量〔J〕.中成药，2010;32(3):162-4.

7 常 徽.植物黄酮抗肿瘤效应的结构-构效关系及ROS相关作用机制研究〔D〕.重庆:第三军医大学，2008.

8 Budzianowski J，Parkuski G，Robak J.Studis on antioxidative activity of some C glycosylflavones〔J〕.J Pharmacol Pharm，1991;43(5):395-9.