高脂血症对模型大鼠血管内皮细胞及血管调节因子的影响

张振强，王丛笑，贾亚泉，宋军营，刘学芳，吕欢欢，张运克

（河南中医学院 科研实验中心，河南 郑州 450008）

高脂血症能够通过损伤内皮细胞，分泌炎症因子和生长因子，诱导单核细胞集聚、粘附于内皮细胞，并迁入内皮下间隙，引起T淋巴细胞的浸润，参与炎症与免疫过程。单核细胞集聚经多种受体介导，不断地摄取已经进入内膜发生氧化的脂质，形成单核细胞源性泡沫细胞；内皮细胞更新、增生并分泌生长因子，可激活动脉中膜平滑肌细胞，并经内弹力膜的窗孔迁入内膜，并发生增生、转化、分泌细胞因子及合成细胞外基质，经其表面的受体介导吞噬脂质，形成平滑肌源性泡沫细胞。在动脉粥样硬化病变过程中，损伤的内皮细胞通过分泌血管调节因子实现对功能血管调节，血管调节因子的变化对血管、组织有何作用，我们实验将其进行分析。

1 资料和方法

1.1 实验动物与分组

健康雄性SPF级12 周 龄Wistar 大鼠，体重280～300g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司（SCXK（京）2007－0001），质量合格证号：0243109。实验动物随机分为正常对照组、高脂血症组，每组10只。

1.2 主要仪器与试剂

1.2.1 主要仪器 全自动生化分析仪（奥林巴斯，型号AU2700）；酶标仪（Thermo，型号MK3）；洗板机（Thermo，型号WELLWASH 4MK2）；自动平衡离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司，型号TDZ5－WS）；DT300A型电子天平（上海医用激光仪器厂常熟分厂）。

1.2.2 主要试剂 体积分数为10%水合氯醛（武汉市和昌化工有限公司）；PBS 缓冲液（上海富众生物科技发展有限公司）；免疫组化试剂von Willebrand、NO、ET－1、6－keto－FGF1a、TX－B2、一抗、二抗及链霉菌抗生物素－过氧化物酶溶液（购自武汉博士德生物工程有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 高脂血症动物模型制备方法 高脂血症组大鼠每天以高脂饲料（组成：3.5%胆固醇、10%猪油、0.2%丙硫氧嘧啶、0.5%胆酸钠、5%白糖、80.8%基础饲料）喂养，正常组以清洁级正常饲料喂养，4周后正常组与高脂血症组分别断尾取血约0.5～1mL，检测血脂四项，高脂血症组血脂指标与正常组相比较具有明显区别，则说明模型制备成功，否则继续饲养。

1.3.2 血清采集 模型制备成功后，每组各取动物5只，以体积分数为10%水合氯醛（0.3mL／100g）腹腔注射麻醉，背位固定于鼠板上，腹主动取血5mL，静置30 min，以3000r／min 离心15 min，取上清液，－20℃冰箱冷冻，备用。

1.3.3 检测血清中总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL－C）和低密度脂蛋白（LDL－C）的含量 取血清0.5～1mL，置于5mL 试管中，按总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDLC）和低密度脂蛋白（LDL－C）试剂盒说明书，采用全自动生化分析仪进行检测。

1.3.4 酶联免疫方法（ELISA） 检测血清中von Willebrand、NO、ET－1、6－keto－FGF1a、TX－B2的 含量，依照试剂盒说明书步骤进行操作。

2 结果

2.1 血脂（总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL－C）、低密度脂蛋白（LDL－C））的检测结果

利用全自动生化分析仪进行血脂检测，测定结果从表1可以看出，与正常组比较，高脂血症组大鼠血清中总胆固醇、高密度脂蛋白、甘油三酯和低密度脂蛋白显著升高，有明显差异（P＜0.05）。

表1 血脂四项检测结果（）

2.2 内皮细胞功能障碍标志物

血管性血友病因子（von Willebrand）的表达情况测定结果从表2可以看出，与正常组相比，高脂血症大鼠的血清中von Willebrand的表达显著增加（0.01＜＊＊P＜0.05）。

2.3 血管调节因子

一氧化氮（NO）、内皮素（ET－1）、6－酮前列环素1a（6－keto－FGF1a）和血栓素B2（TX－B2）的表达情况从表3结果中可以看出，与正常组相比，高脂血症组大鼠的血清中一氧化氮（NO）和6－酮前列环素1a（6－keto－FGF1a）的表达降低，差异显著（0.01＜P＜0.05），而血栓素B2（TX－B2）的表达明显增加（P＜0.05），内皮素的表达没有显著变化。

表2 内皮细胞功能障碍标志物von Willebrand因子的表达情况（）

表3 血管调节因子（NO、ET－1、6－keto－FGF1a、TX－B2）的表达情况（）

3 讨论

血管内皮细胞的完整性是维持正常血流状态、血管通透性及防御炎症反应的基础［1］。高脂血症可引起内皮细胞损伤，尤其OX－LDL 是造成内皮细胞损伤、诱导内皮细胞促炎症分子表达的主要因素［2］。血管性假血友病因子（vWF）反应内皮功能的敏感指标。我们研究显示，2 组间差异显著（0.01＜P＜0.05），表明高脂血症大鼠模型的血管内皮细胞明显受损。

血管内皮细胞通过合成和释放NO、PGI2、ET－1等生物活性物质，调节生理条件下小血管的舒张和收缩、抑制血小板聚集、炎症细胞浸润及炎症因子的过度表达［3］。血管内皮细胞是动脉硬化的始动环节，血脂成份通过血管内皮细胞表面受体进入内皮细胞并迁移至内皮下积聚，刺激平滑肌的增生，引起内皮细胞功能障碍及损伤，使NO、PGI2、ET－1等表达失衡，启动病理过程的发生［4］。

NO／ET－1主要由内皮细胞合成和分泌的一对功能拮抗的活性物质。ET－1有收缩血管、血小板集聚及平滑肌增殖等功能，能够协同生长因子。促进生长因子促平滑肌的增殖，是动脉硬化的重要因素之一［5］。NO 具有舒张血管、抗氧化和传递细胞间生物信息的作用，同时，还可抑制SMC 增殖、血小板集聚、单核细胞黏附、胶原纤维生成等，对血管壁起到保护作用［6］。

PGI2／TX－A2具有调节血管功能。PGI2由内皮细胞合成和分泌，具有舒张血管、抑制血小板集聚和平滑肌增殖等功能［7－8］。TX－A2主要具有血小板颗粒合成和释放、收缩血管和促使血小板聚集的功能［9］。由于PGI2／TX－A2性质不稳定，半衰期较短，常测定其代谢物6－keto－FGF1a、TX－B2含量以代表PGI2和TX－A2的表达情况。

研究结果显示，高脂血症模型组NO、6－keto－FGF1a与对照组相比，含量降低，有显著性差异（0.01＜P＜0.05），TX－B2则升高，有明显差异（P＜0.05）。这表明高脂血症模型可能通过血管内皮细胞功能失衡，减少NO、PGI2的分泌，使ET－1相对升高，激活血小板颗粒，释放TX－A2，诱发形成动脉硬化。虽然血管收缩因子ET－1、TX－A2相对或绝对升高，但平滑肌处于增生状态，不一定能够表现出血管收缩的功能。

高脂血症诱发血管动脉硬化的病理过程复杂，其中内皮细胞损伤是关键因素［10］。我们研究表明，血管调节因子的失衡可能在动脉硬化发病过程中起一定的作用。保护内皮细胞或平衡血管调节因子可能是防治高脂血症诱发早期动脉硬化病变过程中的一个关键节点。

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［10］张振强，宋军营，贾亚泉.缺血性脑血管疾病研究进展［J］.河南大学报：医学版，2012，31（4），312－317.