槲皮素对过氧化氢诱导的血管内皮细胞的保护作用

王志新，马 钊，邓同兴，闫志勇，常 成，张勤安，高晓群＊

（1.郑州大学基础医学院 人体解剖教研室，河南 郑州 450052；2.漯河医学高等专科学校 人体解剖教研室，河南 漯河 462002）

血管内皮细胞是一层连续覆盖整个血管腔表面的扁平细胞。它不仅具有屏障功能，而且有重要的内分泌功能。当血管内皮细胞受损时，其功能发生失调，会导致动脉粥样硬化、脑缺血、高血压、心肌梗死等心血管疾病的发生［1－2］。槲皮素（quercetin）是黄酮类化合物，广泛存在于野生植物、蔬菜、水果和多种中草药中。研究［3］表明，它具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抑制血小板聚集等作用。我们采用过氧化氢诱导内皮细胞损伤作为体外模型，研究了槲皮素对过氧化氢诱导的内皮细胞损伤的保护作用，为其应用于心血管疾病提供实验依据。

1 资料和方法

1.1 一般资料

槲皮素（Sigma产品）；胰酶（Trypsin，北京沃德赛斯生物技术公司产品）；1640培养基（美国GIBCOBRL公司产品）；新生牛血清（美国GIBCOBRL 公司产品）；MDA、SOD 试剂盒（南京建成生物工程研究所产品）；其他常用无机试剂均为国产分析纯。Super T21离心机（美国科峻仪器公司）；Tj－6 离心机（美国Beckman公司）；MCO－15AC 二氧化碳培养箱（日本SANYO 公司）；DL－CJ－1N 高性能无菌实验台（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；AIC UV－9100型紫外分光光度计（北京第二光学仪器厂）；XDS－1B 双相倒置显微镜（重庆光电仪器总公司）。

1.2 方法

1.2.1 内皮细胞培养［4］用戊巴比妥钠将体质量160～180g的雄性大鼠麻醉，取出胸主动脉，放入含有双抗的体积分数为20%小牛血清中，用眼科剪纵向剪开主动脉段，用眼科直镊轻轻刮动内膜，滴加3滴培养液于内膜上，将含细胞的培养液加入预先铺有鼠尾胶原的培养瓶中，培养瓶置二氧化碳培养箱（37℃，体积分数为5% CO2）。细胞融合后，呈铺路石样镶嵌式单层排列，胰酶消化后进行传代。

1.2.2 槲皮素对过氧化氢诱导内皮细胞损伤的作用［5］选取5代的内皮细胞，将细胞以5×104／mL的密度接种于96孔板中，每孔200μL，37℃、体积分数为5%CO2饱和湿度条件下培养。待细胞长满单层后，弃去上层培养液，用PBS 洗2次。实验分为正常细胞组、H2O2损伤组（150μmol／L）、给药组（20、40、80μmol／L）。受试药作用24h后，除正常细胞组外，其余各组每孔迅速加入预冷的H2O2溶液10μL，轻轻摇匀，37℃、体积分数为5% CO2饱和湿度条件下培养。3h 后，镜下观察细胞形态。用PBS 轻轻洗2次，每孔加入含0.5g／L MTT的无血清1640培养液100μL，37℃、体积分数为5%CO2饱和湿度条件下培养4h 后，弃原培养液，每孔加入DMSO 200μL，摇床上振摇10min，用全自动酶标仪测定570nm 处的吸光度（OD570nm），用于定量细胞存活率。参照以下公式计算细胞存活率。

细胞存活率%＝实验组OD570nm／正常组OD570nm×100%

1.2.3 槲皮素对损伤内皮细胞培养液中NO 含量的影响［6－7］将细胞以5×104／mL的密度接种于96孔板中，按上述条件处理，收集细胞培养液。取培养液75 μL，再加75 μL的Griess 试剂，室温放置15min，酶标仪测定570nm 吸光度值。梯度NaNO2作标准曲线，根据OD570nm计算出NO 含量。

1.2.4 槲皮素对损伤内皮细胞培养液中MDA、SOD的影响［8－9］将细胞以5×104／mL的密度接种于24孔板中，按上述条件处理，收集细胞培养液，按试剂盒说明书测定培养液中MDA 含量、SOD 活力。

2 结果

2.1 槲皮素对H2O2诱导的内皮细胞氧化损伤的影响

表1所示，正常细胞组的OD 值为0.58±0.04，终浓度为150μmol／L的H2O2作用3h后，OD 值降低为0.35±0.03，且细胞存活率明显降低。与正常组相比有显著性差异（P＜0.01），说明细胞损伤模型成功；与H2O2损伤组相比，终浓度为20、40、80μmol／L的槲皮素可以浓度依赖性升高OD570nm，将细胞存活率提高至（68.7±3.5）%、（75.8±3.6）%、（83.3±3.7）%，且与损伤组相比有显著性差异（P＜0.05，P＜0.01）。

2.2 槲皮素对H2O2损伤内皮细胞培养液中NO 含量的影响

表2所示，与正常细胞组相比，H2O2损伤组的NO 含量明显降低（P＜0.01）；与H2O2损伤组相比，浓度为20、40、80μmol／L的槲皮素能浓度依赖性提高细胞培养液中的NO 含量，且有显著性差异（P＜0.05，P＜0.01）。

2.3 槲皮素对H2O2损伤内皮细胞培养液中MDA含 量、SOD 活力的影响

表3 所示，与正常细胞组相比，终浓度为150μmol／L的H2O2作用3h后，MDA 含量明显增加，说明细胞损伤模型成功；与H2O2损伤组相比，终浓度为20、40、80μmol／L的槲皮素可降低MDA 含量，且在浓度为40、80μmol／L时，与H2O2损伤组相比有显著性差异（P＜0.05，P＜0.01）。与正常细胞组相比，终浓度为150μmol／L的H2O2作用3h后，SOD 活性明显降低，说明细胞损伤模型成功；与H2O2损伤组相比，终浓度为20、40、80μmol／L的槲皮素可浓度依赖性升高SOD 活性；与H2O2损伤组相比有显著性差异（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 槲皮素对H2O2诱导的内皮细胞氧化损伤的影响（n＝6）

表2 槲皮素对H2O2损伤内皮细胞培养液中NO 含量的影响（n＝6）

表3 槲皮素对H2O2损伤内皮细胞培养液中MDA、SOD 活力的影响（n＝3）

3 讨论

MTT 参与活细胞的能量代谢，可被活细胞线粒体腺苷三磷酸酶分解，形成蓝紫色结晶物，而死细胞无此功能。该蓝紫色结晶物能被DMSO 溶解，在570nm 处有一个较大吸收峰，在酶标仪上可测定其吸收值（OD570nm）。该值可直接反映活细胞的数量和活性，OD570nm值降低表明活细胞数量减少，细胞活性下降［10］。实验发现，H2O2诱导内皮细胞损伤，使内皮细胞的存活率明显下降。 预先加入20～80μmol／L的槲皮素则可浓度依赖性地增加细胞存活率，保护内皮细胞。NO 是血管内皮衍生舒张因子，具有舒血管、抗氧化、抗炎、抗血小板聚集等作用［11］。实验发现，内皮细胞在H2O2刺激下，NO 生成量明显下降，和对照组相比有显著性差异（P＜0.01）。加入槲皮素后，NO 生成量明显升高，与H2O2组相比有显著性差异。

MDA的含量反映机体脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤的程度。我们采用硫代巴比妥法测定了H2O2损伤的内皮细胞培养液中MDA的含量。结果显示，与正常细胞组相比，终浓度为150μmol／L的H2O2作用3h后，MDA 含量明显增加。用槲皮素预处理后，则可不同程度地抑制由H2O2损伤引起的MDA 含量升高，说明槲皮素可通过抑制脂质过氧化而减轻H2O2造成的细胞损伤。机体在正常情况下，存在完善的抗氧化体系，如SOD、CAT、GSH－Px等。其中SOD 是抗氧化体系的重要组成部分［12］，是机体内清除自由基的第一线防卫。主要清除超氧阴离子自由基，SOD 活性的高低间接反映机体清除氧自由基的能力。实验发现，与正常细胞组相比，终浓度为150μmol／L的H2O2作用3h后，细胞SOD 活性明显降低。说明H2O2处理细胞后，降低了细胞的抗氧化能力，导致细胞内自由基增多，从而抑制了内皮细胞的增殖；而20～80μmol／L的槲皮素可显著升高H2O2损伤的内皮细胞的SOD 活性，提示槲皮素通过增强细胞清除自由基的能力来保护细胞免受自由基诱发的氧化损伤。

我们的研究表明，过氧化氢可导致内皮细胞发生氧化损伤。加入20～80μmol／L的槲皮素预处理后，可明显保护受损的内皮细胞，其保护作用与促进细胞释放的NO、抑制脂质过氧化以及清除氧自由基有关。

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