直链烷基苯磺酸钠对小鼠精子成熟和生育能力的影响

窦晓卫，任春娥，柏宏伟，刘洪香，张安清

(潍坊医学院，山东 潍坊 261042)

精子成熟是一个复杂的过程，在睾丸内生成的精子没有良好的活动能力。在从睾丸向附睾的输送过程中逐渐完成形态和功能的转变，因此附睾是促进精子成熟、储存的重要器官［1］。直链烷基苯磺酸钠(linear alkylbenzene sulphonates，LAS)是合成洗涤剂的表面活性物质，其对睾丸结构和生殖能力的影响已有相关报道［2］，而亚慢性或慢性LAS染毒对哺乳动物生殖能力的影响却鲜有报道，尤其是对精子成熟过程及相关作用机制的研究甚少。本实验采用昆明雄系小鼠作为动物模型，观察附睾头和附睾尾精子的功能参数，结合与正常雌鼠交配后所生子代的情况，评价直链烷基苯磺酸钠对小鼠精子成熟和生育能力的影响，为研究LAS 的生殖毒性机制提供相应的参考资料。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 直链烷基苯磺酸钠(LAS，C18，有效含量不低于95%，天津市科密欧化学试剂有限公司)，伊红染液、苏木素染液、二甲苯、中性树胶等，WLJY 精子分析系统，YD－AB 型生物组织摊烤片机，BX41TF 光学显微镜，H－7500透射电镜等。

1.2 实验动物及染毒模型的建立 健康雄性昆明小鼠60 只，鼠龄4 周，体重29～34 g，随机分为实验组A (LAS 630 mg/kg)，实验组B (LAS 315 mg/kg)，对照组C (生理盐水)，每组20 只。实验组小鼠经口摄入直链烷基苯磺酸钠，每日1 次，连续染毒60 天，各组小鼠均常规饲养，光照10 h/d，自由饮食和饮水。雌鼠30 只，6～8 周龄，体重20～25 g，常规饲养1 周，用于与雄鼠的交配。

1.3 小鼠附睾精子参数的检测 染毒60 天时，颈椎脱臼法处死小鼠，每组处死10 只，迅速解剖取附睾头和附睾尾，分别置于1 mL 的生理盐水中(37℃预热)，孵育1 分钟后，常规精液涂片，光学显微镜下至少观察100 个精子，计数精子密度、活力及胞浆小滴率。应用改良的巴氏染色法进行精子形态学分析，计数精子畸形率，观察精子畸形的种类。

1.4 小鼠附睾尾精子的透射电镜观察 常规方法制备小鼠附睾尾精子的透射电镜切片［3］，观察精子的超微结构。

1.5 小鼠的生殖能力试验 经各组中未处死的雄鼠(n=10)，分别与正常雌鼠交配，雌雄比例为1∶1，自合笼后起每日观察雌鼠阴栓，发现阴栓为怀孕的第1 天，计数孕鼠的比例，孕鼠常规饲养18 天后解剖，观察胎鼠的情况。

1.6 统计学处理 所得结果采用SPSS17.0 统计软件进行数据处理，组间比较进行单因素方差分析及q 检验，P ＜0.05 为有统计学意义。

2 结 果

2.1 LAS 对小鼠附睾头和附睾尾精子各项功能参数的影响 对照组小鼠附睾尾精子多表现为快速向前运动，附睾头精子运动相对微弱，多为原位摆动或缓慢转动。和对照组小鼠相比，实验组小鼠附睾头和附睾尾精子密度、活力均显著降低(P ＜0.001，P ＜0.05)，精子畸形率显著升高(P ＜0.001)，且具有明显的剂量效应关系(见表1－3)。对照组小鼠中附睾头精子含胞浆小滴率为70.5%，附睾尾精子为29.9%;低剂量染毒组小鼠胞浆小滴率从附睾头的72.7%降至附睾尾精子的41.6%，即有31.1%的胞浆小滴脱落;而精子胞浆小滴脱落的异常在高剂量染毒组小鼠中则变现的更为显著，从附睾头精子的79.8% 降到附睾尾精子的61.6%，即仅有18.2%的胞浆小滴脱落。见图1。

表1 LAS 对小鼠附睾头和附睾尾精子密度的影响(n=10，，×106/mL)

表2 LAS 对小鼠附睾头和附睾尾精子活力的影响(n=10，，%)

表3 LAS 对小鼠畸形精子率的影响(n=10，，%)

2.2 LAS 对小鼠精子形态学的改变 光学显微镜下，对照组小鼠精子头部呈镰刀状，尾部细长，附睾头精子和附睾尾精子最明显的形态学差异在于胞浆小滴，附睾头精子含胞浆小滴者多，且多位于尾部颈段，使精子尾部明显弯曲。实验组小鼠附睾尾精子的胞浆小滴率明显增加，且有多种头部和尾部畸形，如双头、香蕉头、断尾等。透射电镜下，对照组小鼠精子9 +2 结构清晰，尾部线粒体排列紧密，大小形态一致。实验组小鼠精子的超微结构发生明显变化，表现为尾部线粒体排列疏松、肿胀、空泡形成等一系列凋亡前征象，并具有明显的剂量效应关系。

2.3 LAS 对小鼠生育能力的影响 经LAS 染毒后，低剂量组和高剂量组小鼠的生育能力均呈不同程度的下降，率的比较采用χ2检验，和对照组相比差异有统计学意义(P ＜0.05)，且呈现出效量效应关系。经解剖后发现实验组孕鼠腹中死胎+吸收胎鼠比例明显高于对照组(P ＜0.05)。

表4 LAS 对小鼠生殖能力的影响

3 讨 论

附睾作为雄性哺乳动物的附属性腺，是精子成熟、保护、运输、贮存的重要部位。附睾上皮细胞的合成、分泌、转运等功能使精子发生一系列结构和功能的改变，从而使精子获得受精和运动能力［4］。本实验观察到经LAS 染毒后的小鼠精子活力显著降低，提示小鼠的附睾功能受到不同程度的损害，使小鼠精子的运动能力下降。

精子在附睾中的成熟要经历非常复杂的过程，其中最主要的变化时精子尾部的胞浆小滴和尾部的卷曲。正常情况下，伴随着精子从附睾头向附睾尾的移行过程中，胞浆小滴同时向尾部末端移动，至精子成熟时，胞浆小滴随之消失［5］。在附睾头部，精子尾部呈卷曲状，随着精子的转运，尾部卷曲的精子数目逐渐下降，至附睾尾部时精子尾部变直。研究表明精子胞浆小滴贮留和附睾功能改变、生育力下降等有关［6］，主要原因是胞浆小滴贮留后改变了精子胞膜脂质组成和代谢而使精子破裂增加［7］。本实验结果表明直链烷基苯磺酸钠可以增加附睾尾部胞浆小滴的残留率。另外，透射电镜下发现，实验组小鼠多见精子核空泡、顶体肿胀和线粒体排列紊乱等超微结构的变化，说明精子在附睾阶段发生了降解性改变，可见LAS 导致精子的附睾成熟降低。

哺乳动物的生殖过程是从受精开始的，而受精能力的获得是在附睾中完成的，本实验中观察到二个染毒剂量组小鼠仍然保持生育能力，但较对照组显著下降，同样可作为附睾功能减退的证据。直链烷基苯磺酸钠属于低毒化学物质，但其应用广泛并缺乏最低安全剂量标准［8］。近年来，LAS 的生殖毒性已引起国内外学者的关注，研究表明LAS 可使生物体内抗氧化酶活性降低，诱发机体脂质过氧化作用，从而干扰细胞内的各种代谢活动，影响细胞的增值和分化［9］。现今为止，在已婚夫妇当中，大于15%的夫妇正受着不孕症的困扰，其中大于50%是由于男性因素引起［10－11］，本实验的研究结果提示LAS 的广泛使用可能会造成潜在的生殖健康危害。包括LAS 等在内的家用化学物品，在为人类带来方便和洁净的同时，造成了潜在的健康危害，构成了社会卫生和安全问题。因此，应加强对LAS 毒性作用机制的研究，为确定最低安全接触量提供实验依据。

总之，本实验以LAS 染毒小鼠作为研究模型，以附睾内精子的各项功能指标作为研究内容，可见LAS 影响了小鼠的附睾成熟过程，并为寻找LAS毒性作用的睾丸后靶点提供一定的实验依据。给予2 个不同剂量的LAS，高剂量组小鼠所受的影响最为显著，此结果对男性生殖健康是有参考意义的。

图2 正常精细形态 HE×400

图3 胞浆小滴阳性精子形态 HE×400

图4 正常精子尾部结构(EM，×20000)，线粒体排列紧密，结构清晰无空泡化现象

图5 实验组小鼠精子结构(EM，×20000)，胞浆内大量空泡形成，精子9 +2 结构不完整，线粒体数目减少，排列疏松

［1］Cornwall GA.New insights into epididymal biology and function［J］.Hum Reprod Update，2009，15 (2):213－227.

［2］莫少耀，李少群，麦惠霞，等.直连烷基笨磺酸钠对雄性大鼠生殖细胞的毒性研究［J］.卫生毒理学杂志，1993，S1:38－42.

［3］朱伟杰，梁蔚波，金庆骝.人类睾丸精子和附睾精子的顶体蛋白酶活性［J］.中国病理生理杂志，1998，14 (5):465－468.

［4］Dacheux JL，Gatti JL，Dacheux F.Contribution of epididymal secretory proteins for spermatozoa maturation ［J］.Microsc Res Teeh，2003，61 (1):7－17.

［5］Matousek J，Kysilka C.The phospholipid－binding protein of the reproductive tract of the bull－effect on the removal of spermatozoal cytoplasm droplets in other species and influence of antibodies on its reactivity ［J］.Anim Reprod Sci，1984，7:433－440.

［6］刘杰，李建远，王海燕，等.精子胞浆小滴的发现及其研究进展［J］.现代生物医学进展，2011，11 (5):976－977.

［7］Ralf Henkel，Gesa Maa.Sperm function and assisted reproduction technology ［J］.Reproductive Medicine and Biology，2005，4:7－30.

［8］张萍，梁岛道.环境激素对人类健康的危害及监测方法［J］.公共卫生与预防医学，2005，16 (6):63－65.

［9］蔡德雷，徐立红，于晓峰，等.餐具洗洁精对小鼠肝脏解毒功能的影响［J］.环境与职业医学，2004，21 (4):267－269.

［10］Seshagiri PB.Molecular insights into the causes of male infertility ［J］.J Biosci，2001，26:429－435.

［11］赵文红，张鼎，周纯先，等.直链烷基苯磺酸钠对果腹果蝇生育能力及寿命的影响［J］.中南大学学报，2011，36(2):154－158.