高效液相定量分析0.01%芸苔素内酯可溶液剂

乔纪伟 郝红英 姚家元 宋 彬 吕建伟

上海绿泽生物科技有限责任公司 （上海 201611）

芸苔素内酯（brassinolide），化学名称（22R,23R,24R）－2α,3α,22,23－四羟基－β－均相－7－氧杂－5α－麦角甾烷－6－酮，相对分子质量（按2007国际相对原子质量计）为480.7，结构式见图1。

图1 芸苔素内酯结构式

植物各个阶段的生长发育是受自身激素的控制和调节的。芸苔素内酯作为新一类植物内源激素，其化学结构和植物性激素极为相近，在很低的浓度下，能明显地增加植物的营养体生长和促进受精作用、增加光合作用强度、增强根系活力、促进根系发育、提高叶绿素含量、延缓叶片衰老、抗倒伏能力增强、提高作物产量，改善作物品质。

有关芸苔素内酯的定量分析，目前尚未见公开报道。本实验采用反相高效液相色谱，使用TC－C18为填料的不锈钢柱和紫外检测器，对芸苔素内酯进行定量分析，方法简便、快速、准确，分离效果好，方法的准确度及精密度均能达到定量分析的要求，适用工业化生产和质量分析。

1 实验部分

1.1 试剂和溶液

吡啶：分析纯；1－萘硼酸：97%分析纯；乙腈：色谱纯；水：新蒸二次蒸馏水；芸苔素内酯标样：质量分数98.0%（市售）；0.01%芸苔素内酯可溶液剂（由某企业提供）。

1－萘硼酸溶液：称取0.04g（精确至0.1mg）1－萘硼酸于100mL容量瓶中，加吡啶溶解并稀释至刻度，摇匀。

流动相：乙腈+水＝85＋15（体积比），于超声波浴中脱气10min,再用0.45μm微孔滤膜过滤。

1.2 仪器

高效液相色谱仪：岛津10Avp,具有可变波长的紫外检测器；色谱数据处理机；色谱柱：250mm×4.6mm(id)不锈钢柱，内装 TC－C18填充物，粒径 5μm；微孔滤膜：0.45μm；微量进样器：25μL；超声波振荡器。

1.3 色谱操作条件

流速：1.0mL/min；柱温：40℃（温差变化不大于2℃）；检测波长：290nm；进样体积：5μL；保留时间：芸苔素内酯异构体1约13.0min、芸苔素内酯异构体2约13.9min、芸苔素内酯异构体3约15.1min、芸苔素内酯异构体4约16.1min。

上述操作条件系典型操作参数，可根据不同仪器特点作适当调整，以获得最佳分离效果。标样与试样溶液高效液相色谱图见图2、图3所示。

1.4 测定步骤

1.4.1 标样溶液的配制

称取芸苔素内酯标样0.02g（精确至0.02mg），置于50mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。准确移取5mL标样溶液于50mL容量瓶中，加入5mL 1－萘硼酸溶液，摇匀，于70℃反应30min，取出，恢复至室温后用乙腈稀释至刻度，摇匀。

1.4.2 试样溶液的配制

称取试样10g（精确至0.02mg）于25mL容量瓶中，加入5mL 1－萘硼酸溶液，摇匀，于70℃反应30min，取出，恢复至室温后用乙腈稀释至刻度，摇匀。

标样溶液和试样溶液在70℃时反应30min要同步进行。

1.4.3 测定

在上述操作条件下，待仪器基线稳定后，连续注入数针标样溶液，计算各针响应值，待相邻两针相对响应值变化小于1.5%时，按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。

1.4.4 计算

将测得的两针试样溶液以及试样前后两针标样溶液中芸苔素内酯的峰面积分别进行平均。芸苔素内酯质量分数 X（%），按式（1）计算：

式中：A1—— 标样溶液中芸苔素内酯异构体1、2、3、4峰面积之和的平均值；

A2——试样溶液中芸苔素内酯异构体1、2、3、4峰面积之和的平均值；

m1——芸苔素内酯标样的质量，g；

m2——试样的质量，g；

P——芸苔素内酯标样的质量分数，%；

20——稀释因子。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

分别使用不同比例的甲醇、乙腈、水作为流动相，对试样进行分离条件选择，结果表明，用乙腈＋水＝85＋15（体积比）作为流动相，分离效果好，出峰时间适中，峰形对称，满足分析要求。

2.2 检测波长的选择

根据反复筛选，芸苔素内酯在290nm波长处有较大的紫外吸收，且在该波长下对乙腈、衍生化试剂均无吸收，确定其为测定波长。

2.3 方法的线性关系试验

配制已知高浓度标准液经1－萘硼酸衍生化后，移取不同浓度的标准溶液至各容量瓶中，定容至相同体积，摇匀。在1.3节表明的操作条件下进行测定，得到相应的峰面积，见表1。

表1 芸苔素内酯浓度与峰面积的线性关系

以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标作图,得到一条直线，线性关系良好，如图4所示。得到回归方程：Y＝3425.4X－9270.9，其相关系数 r＝0.9997。

2.4 方法的精密度试验

取一经衍生化后的试样，按本标准1.3节方法对同一样品进行7次平行测定，测定相对标准偏差RSD，结果见表2。

表2 芸苔素内酯测定方法的精密度试验

2.5 方法的准确度试验

称取已知含量的试样及已知质量的标准品，分别加入1－萘硼酸衍生化试剂，在70℃下保温30min,同时取出冷却至室温，用移液管移取5份样品于25mL容量瓶中，按配制值分别精确移入标准液，组成5份不同浓度的芸苔素内酯加标溶液，用乙腈稀释至刻度，摇匀后按1.3节操作条件下进行测定，根据试液配制值与峰面积，分别计算5份加标液回收率，结果见表3。

表3 方法回收率试验

3 结论

（1）根据表1所示芸苔素内酯浓度与响应值线性关系，测得线性范围在19.6～196μg/mL之间，相关系数r＝0.9997。符合CIPAC《确认农药制剂分析方法准则》要求，相关系数r≥0.99。

（2）根据表2所示经7次重复测定试验，平均值为0.0099%，依据CIPAC相对标准偏差RSD≤2(1-0.5logC)×0.67，当浓度为0.0099%时RSD应为2.68，实测变异系数RSD为2.27，可被CIPAC准则要求所接受。

（3）根据表3实测结果，方法回收率在98.9%～107.4%之间，CIPAC要求当被测物浓度＜0.1%时，回收率可在75%～125%之间。此验证结果符合CIPAC准则要求。

采用高效液相色谱法分析芸苔素内酯0.01%可溶液剂含量，其线性关系、精密度、准确度均符合CIPAC要求，检测方法简便、快速，能满足工业化生产和质量控制要求。

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