小鼠Mmp－9 shRNA重组慢病毒包装、筛选及干扰效果检测＊

第四军医大学西京医院整形科（西安710032） 张冠华 易成刚 马戈甲 杨 力

基质金属蛋白酶9（Matrix metalloproteinase 9，Mmp9）是92 k Da IV型胶原酶的糖化形式，其底物是变性的间质胶原、V型胶原和IV型胶原。它通过切割包括弹性蛋白、纤维连接蛋白和层粘连蛋白在内的非胶原细胞外基质来破坏血管结构，为肿瘤侵袭性生长、复发及转移提供条件［1］。因此，日益引起学者重视。

RNA干扰 （RNA interf erence，RNAi）是内源性基因或人工导入基因，是进入细胞后与靶基因互补的小干扰双链RNA（si RNA）序列引起转录后基因沉默的一种现象［2］。因其简便易行并且具有特异性和高效性，已经成为研究基因功能和基因表达调控的重要方法。本研究构建靶向抑制小鼠Mmp9的si RNA干扰载体，并进行慢病毒包装制成慢病毒浓缩液，为血管化性疾病的防治研究提供理论依据及实验室数据。

材料和方法

1 主要试剂和仪器 慢病毒载体系统由p SILRFP载体、p Hel per1．0载体和p Helper2．0载体三质粒组成。大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞。LB培养基（Sig ma，美国）；PCR试剂盒（Takara，大连）；ds DNA oligo（奥科生物，北京）；质粒小提试剂盒（Bio mega，美国）；质粒大提试剂盒（Qiagen，美国）；CaCl2（Sig ma，美国）；Mg SO4（Sig ma，美国）；T4DNA ligase试剂盒（NEB，英国）；琼脂糖（赛百盛，北京）；限制性内切酶（NEB，英国）；测序（华大基因，北京）。

2 方 法

2．1 sh RNA的设计：针对靶基因序列，按照RNA干扰设计序列设计原则，运用美国Ambition公司的软件设计携带小鼠Mmp9基因（NM－013599）si RNA序列的sh RNAs结构单链寡核苷酸，并合成3对单链寡核苷酸。每一正向单链内的寡核苷酸以正反向组合，中间添加Loop结构，使寡核苷酸形成发夹结构，每对寡核苷酸两端分别带有AgeΙ和Eco RΙ酶切位点。

2．2 Mmp9－sh RNA慢病毒……