定量PCR检测激光切割的若干细胞中基因NGF转录本

黄国韦

（汕头大学 医学院病理学教研室，广东 汕头 515041）

激光显微切割技术能够切割特定的靶细胞并进行核酸、蛋白分析.目前，激光显微切割技术可以切割至少200个细胞，并提取总RNA后，运用定量PCR技术分析基因的转录本[1].然而，切割少量细胞进行基因转录本的分析尚未见报道，本研究方案运用激光显微切割技术切割20个大鼠海马神经元细胞，在不提取RNA的情况下，进行NGF基因转录本的定量检测.

1 材料与方法

1.1 材料

SD大鼠，显微切割专用载玻片，0.5ml PCR管（EPPENDORF），无RNA酶的吸头、八连管（Xygene），DNase I（Invitrogen）,NP-40(上海生工),小鼠抗NeuN（Millipore），驴抗小鼠IgG偶联 NL577荧光基团(R&D)，定量PCR检测试剂盒（Takara），引物（上海生工）、7300定量PCR仪（ABI），反转录试剂盒（Toyobo），全自动激光切割系统（Leica）.所有的PBS均用DEPC水处理.

1.2 方法

1.2.1 免疫荧光

出生后2-3个月大鼠被断颈处死，去除海马组织，在液氮中速冻后进行冷冻切片，切片厚度为5μm，95%的乙醇固定5分钟后，用含2M NaCl的PBS洗涤，小鼠抗NeuN的抗体室温抚育5分钟，洗涤后再用驴抗小鼠IgG偶联NL577荧光基团室温抚育5分钟，用含2M NaCl的PBS洗涤后，95%乙醇、100%乙醇、二甲苯依次处理1分钟，进行显微切割.

1.2.2 细胞裂解

提前滴加含3%NP-40的DNaseI buffer 10μl在0.5mlPCR管盖上，切割的细胞收集在管盖中，置于42°C抚育20分钟，管子倒置.

1.2.3 DNase I处理RNA后进行反转录

添加 2ul DNase I buffer、2ul DNase I、6ul无核酸酶水至上述离心管中，室温放置15分钟后进行反转录.反转录体系如下：4μl 10x RT buffer,4μl 25mM MgCl2,2μl 0.1M DTT,1μl 40U/μl RNaseOUT,1μl 200U/μl SuperScipt III RT.管子倒置，室温10分钟，再置于50℃的水浴锅中50分钟后，置于85℃ 5分钟，1μl RNase H添加至反应体系中，37℃ 20分钟后，进行定量PCR检测.

1.2.4 定量PCR检测

50μl的反应体系由 25μl Sybr Premix Ex Taq,1μl ROX reference dye,0.125μl 40pmol/μl上游引物,0.125μl 40 pmol/μl下游,2μl cDNA模板和21.75μl无核酸酶的水.反应体系按照95℃，5秒；60℃退……