高效液相色谱法测定鸡肉中磺胺类药物残留的不确定度评定

赵健亚，陈 丹，谢怀根，肖 静,*

(1.南通大学公共卫生学院，江苏 南通 226019；2.南通市动物疫病预防控制中心，江苏 南通 226006)

一切测量结果都不可避免地具有不确定度，测量不确定度是表征赋予被测量量值分散性的非负参数[1-2]，它可以定量表示测量结果的质量，只有附上不确定度说明才能实现检测结果的完整表达[3-4]。磺胺类药物属广谱抗菌药，价格低廉，是治疗畜禽感染的常用兽药[5]。由于其在动物体内作用时间和代谢时间较长，易造成可食组织残留，给人类健康带来危害[6]。各国对动物性食品中磺胺类药物残留严格规定了限量标准，欧盟规定总残留不应超过0.1mg/kg[7]。本实验依据JJF 1059—1999《测量不确定度评定与表示》[1]和CNAS—GL06《化学分析中不确定度的评估指南》[8]规定的基本方法和程序，对高效液相色谱法测定鸡肉中磺胺类药物残留的不确定度进行分析评定，找出主要分量，在实验过程中重点控制从而提高检测质量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品为市区农贸市场随机抽查的鸡肉。

5种磺胺标准品：磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺二甲基嘧啶(SM2)、磺胺甲恶唑(SMZ)和磺胺二甲氧嘧啶(SDM)(纯度均为99%)，磺胺喹恶啉(SQ)(纯度为97.2%) 美国Sigma公司；乙腈(色谱纯) 德国Meker公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

1100高效液相色谱系统(配紫外检测器和自动进样器) 美国Agilent公司；3K15台式高速冷冻离心机 德国Sigma公司；AB265-S分析天平 瑞士Mettler公司；AB204-N分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；R-215旋转蒸发仪 瑞士Büchi公司；Bond-Elut-Al-B固相萃取柱(500mg/3mL) 美国Varian公司。

1.3 样品前处理方法

参考NY502—2001《磺胺类药物在动物可食性组织中残留的高效液相色谱检测方法》[9]进行。

1.4 标准溶液配制

1.4.1 单标储备液的配制分别准确称取5种磺胺标准品50mg于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，质量浓度为1mg/mL。

1.4.2 混合标准中间液的配制

分别准确吸取以上5种单标储备液各1mL置100mL容量瓶中，用流动相稀释并定容，得到质量浓度10μg/mL的混合标准中间液。

1.4.3 混合标准工作液的配制

按表1配制方法用流动相将混合标准中间液逐级稀释成质量浓度为1.0、0.5、0.2、0.1、0.05μg/mL的混合标准工作液。

表1 标准工作液的配制Table 1 Preparation of standard working solution

1.5 色谱条件

色谱柱：C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-甲醇-水-乙酸(2：2：9：0.2，V/V)；流速：1.0mL/min；检测波长：270nm；柱温：室温；进样量20μL。

2 结果与分析

2.1 数学模型

式中：W为样品中磺胺类药物含量/(mg/kg)；C0为定容液中磺胺类药物质量浓度/(μg/mL)；VX为样液定容体积/mL；m为样品质量/g；fr为回收率校正因子。

2.2 不确定度的来源分析

从实际测量过程和数学模型分析，磺胺类药物残留测定的不确定度主要来源于标准溶液配制、标准曲线拟合、样品前处理、测量重复性等[10]。

2.3 不确定度分量的评定

2.3.1 标准溶液配制引入的不确定度

2.3.1.1 标准物质纯度引入的相对标准不确定度urel(p)

标准品证书给出SMM、SM2、SMZ和SDM的扩展不确定度为0.5%，包含因子k＝2，4种标准物质的标准不确定度均为u(p)1=0.5%/2=2.500×10-3，则urel(p)1=2.500×10-3/ 99%=2.525×10-3；证书给出SQ的扩展不确定度为1%，包含因子k＝2，其标准不确定度为u(p)2=1%/2=5.000×10-3，则urel(p)2=5.000×10-3/97.2%=5.144×10-3。

2.3.1.2 标准物质称量引入的相对标准不确定度urel(m)

2.3.1.3 标准工作液配制过程引入的相对标准不确定度urel(V)1)量器校准引入的相对标准不确定度urel(V)1

表2 量器校准引入的不确定度Table 2 Uncertainties caused by glass container calibration

表3 环境温度变化引入的不确定度Table 3 Uncertainties caused by environmental temperature change

2.3.1.4 合成标准溶液配制的相对标准不确定度urel(std)

2.3.2 标准曲线拟合引入的相对标准不确定度urel(C0)

表4 5种磺胺类药物的标准曲线测定结果和不确定度计算Table 4 Standard curves of five sulfonamides and uncertainties

2.3.3 样品前处理引入的不确定度

2.3.3.1 样品称量引入的相对标准不确定度urel(m’)

2.3.3.2 试样定容体积引入的相对标准不确定度urel(VX)

表5 5种磺胺类药物的加标回收率测定结果和不确定度计算Table 5 Recoveries of five sulfonamides at different spike levels and uncertainties

2.3.4 样品重复测定引入的相对标准不确定度urel(Wrep)

表6 重复测定结果和不确定度计算Table 6 Results of repeatability and uncertainties

2.4 合成不确定度及检测结果表述

表7 不确定度评定结果Table 7 Uncertainty evaluation for the determination of five sulfonamides

3 结 论

通过对高效液相色谱法测定鸡肉中磺胺类药物残留的不确定度各分量的评定，可见最终结果的不确定度主要由标准曲线拟合、样品前处理过程和测量重复性引起，其次为标准溶液配制过程。实际操作过程中可通过增加混合标准系列工作液测定次数、优化样品前处理方法、增加平行样测定及选择精度较高玻璃量器来减小引入的不确定度，从而提高检测质量。

[1] 国家质量技术监督局. JJF 1059—1999测量不确定度评定与表示[S]. 北京： 中国计量出版社, 1999.

[2] JCGM 200： 2008, International vocabulary of basic and general terms in metrology(VIM). 3rd edition[S]. BIPM and ISO, 2008.

[3] 国家质量技术监督局计量司. 测量不确定度评定与表示指南[S]. 北京： 中国计量出版社, 2000.

[4] ISO-ISBN 92-67-10188-9 Guide to the expression of uncertainty in measurement[S]. Geneva, 1995.

[5] 沈建忠, 谢联金. 兽医药理学[M]. 北京： 中国农业大学出版社, 2000： 155.

[6] 李俊锁, 邱月明, 王超, 等. 兽药残留分析[M]. 上海： 上海科学技术出版社, 2002： 232.

[7] The Commission of the European Communities. Council Regulation (EEC) No 2377/90 laying down a Community procedure for the establishment of maximum residue limits of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin[J]. Off J Eur Commun, 1990, 62(2)： 16-17.

[8] 中国合格评定国家认可委员会. CNAS—GL06 化学分析中不确定度的评估指南[S]. 北京： 中国计量出版社, 2006.

[9] 中华人民共和国农业部. NY 5029—2001 无公害食品猪肉附录E磺胺类药物在动物可食性组织中残留的高效液相色谱检测方法[S].

[10] 国家质量监督检验检疫总局. JJF 1135—2005 化学分析测量不确定度评定[S]. 北京： 中国计量出版社, 2005.

[11] 国家质量监督检验检疫总局. JJG 196—2006 常用玻璃量器检定规程[S]. 北京： 中国计量出版社, 2006.