壳聚糖涂膜对冷藏美国红鱼品质的影响

李婷婷，励建荣*，赵 崴

(1.大连民族学院生命科学学院，辽宁 大连 116600；2.渤海大学食品科学研究院，辽宁省食品安全重点实验室，辽宁 锦州 121013；3.大连天宝绿色食品股份有限公司，辽宁 大连 116001)

美国红鱼(red drum，Sciaenops ocellatus)，学名眼斑拟石首鱼，俗称红鱼、红姑鱼、斑尾鱼、海峡鲈，为鲈形目、石首鱼科、拟石首鱼属，属广温广盐溯河性鱼类，淡水、半咸水、海水中均可正常生长，是一种商品经济价值较高的海产鱼类。鱼体内含有多种无机盐、维生素和微量元素等，同时具有丰富的营养价值和良好的保健功能。美国红鱼作为一种高蛋白、低脂肪的海产经济鱼类，现已成为世界上养殖产量最高的鱼种之一，也是国际上高档的热销水产品之一[1]。

然而，作为水产品的一般特性，美国红鱼由于其较高的水分和蛋白质含量，肌肉组织较松软，组织蛋白酶活性较强，死后僵硬期短，自溶作用快，极易在捕捞、运输、加工及贮藏过程中受细菌侵袭而腐败变质，导致货架期短、难以保藏[2-3]。为此，寻求一种既经济又安全且操作简便的保鲜技术，在不添置任何附加设备的情况下，采用新颖安全的生物保鲜剂来延长美国红鱼的货架期，已成为目前水产品加工业极需解决的课题。随着我国美国红鱼养殖业和产量的逐年扩增，美国红鱼的保鲜加工必将成为今后长期主要工作之一。

壳聚糖(chitosan)又称甲壳素(chitin)、几丁质、脱乙酰甲壳素、聚氨基葡萄糖等，是甲壳素N-脱去乙酰基的产物，其化学结构是由大部分氨基葡萄糖和少量的N-乙酰葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接起来的聚阳离子高分子直链多糖。由于其是天然多糖中大量存在的唯一碱性氨基多糖，其来源丰富，制备简单，保鲜性能优越，同时具有抑菌等一系列特殊的功能性质，而且其降解产物一般在人体内不积蓄，对人体也无毒副作用、无免疫原性[4-6]。目前，壳聚糖在食品中常作为抑菌保鲜剂，不仅可在果蔬保鲜中受到广泛的应用，同时也在水产品贮藏过程中得到了普遍的应用[7-8]。但利用壳聚糖涂膜保鲜美国红鱼片还没有相关的研究，鉴于此，本研究分析了不同质量浓度壳聚糖涂膜后对美国红鱼品质的变化，并通过检测其微生物、pH值、硫代巴比妥酸(TBA)值、挥发性盐基氮(TVB-N)含量、K值以及质构、感官等鲜度指标来比较不同质量浓度壳聚糖对美国红鱼品质的影响，为壳聚糖涂膜在美国红鱼保鲜中的进一步应用提供参考和借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

美国红鱼 市购；壳聚糖(脱乙酰度为大于85%，食品级) 宁波市镇海海鑫生物制品有限公司；ATP关联物ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx 标准品 美国Sigma公司；甲醇、乙腈为色谱纯；其余试剂为分析纯。

1.2 仪器与设备

1100 LC液相仪 美国Agilent公司；CR400 色差仪 日本KonicaMinolta公司；KJELTEC2300全自动凯氏定氮仪 丹麦Foss公司；UV-2000紫外-可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司；DK-S24电热恒温水浴锅、GRP-9080隔水恒温培养箱 上海森信实验仪器有限公司；BS223S精密电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；BCD-277西门子冰箱 博西华家用电器有限公司；PHS-3E PH计 上海精密科学仪器有限公司；KQ5200DB型数控超声清洗器 昆山市超声仪器有限公司；TA.XT.plus质构仪 Stable Micro Systems公司；THZ-C-1恒低温气浴摇床 上海丰盟科技材料有限公司。

1.3 方法

1.3.1 美国红鱼处理方式

将鲜活美国红鱼采用碎冰冻死后，用双蒸水清洗、并切成长5cm宽2cm厚1cm的鱼片。然后将沥干的鱼片分成5组，分别浸泡于不同质量浓度的壳聚糖溶液(壳聚糖的水溶液在4℃冰库中预冷却)：A为0.5%冰乙酸+0.5%甘油(对照组)；B、C、D、E为在对照组的配方基础上添加质量浓度分别为1.0、1.5、2.0、3.0g/100mL壳聚糖。浸泡时间为10min(冰乙酸甘油均为体积分数)。取出沥干后，采用蒸煮袋包装于4℃冰箱中贮藏。样品分别在第0、4、8、12、16、20天取样测定其感官、微生物以及各个理化指标的变化。每次随机取样3组，测平均值。

1.3.2 测定指标

鱼肉基本营养成分：水分含量按照GB 5009.3—2010《食品中水分的测定》中直接干燥法测定，在105℃条件下干燥至恒质量；蛋白质含量采用凯氏定氮法测定，蛋白质系数选择6.25；脂肪含量按GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的测定》中酸水解法测定；灰分含量按GB 5009.4—2010《食品中灰分的测定》测定；细菌总数的测定：按GB 4789.2—2010《菌落总数测定》进行测定，采用平板倾注法计数测定；pH值测定：依照GB/T 5009.45—2003《水产品卫生标准的分析方法》中的酸度计法，称取5～8g左右搅碎鱼肉，加入10倍质量体积新煮沸后冷却的双蒸水，均质，静止过滤后，测其上清液pH值。

TBA值测定：参考Siu等[9]的TBA测定方法，称取10g搅碎鱼肉，加入25mL双蒸水，均质后，再加入25mL 5g/100mL三氯乙酸(TCA)搅匀，静止30min。然后，取5mL上清液，加入5mL 0.02mol/L的TBA溶液。混合液在80℃恒温水浴加热40min显色，冷却至室温后，在532nm波长处测定吸光度。TBA值用丙二醛(MDA)的含量表示，单位为mg MDA/kg。

TVB-N含量测定：使用全自动定氮仪，参考“FOSS应用子报[10]”中《鲜鱼和冻鱼中挥发性盐基氮(TVB-N)的测定》测定鱼丸中的TVB-N含量(mg/100g)。

K值的测定：按照Ryder等[11]的方法，美国红鱼片ATP关联物的提取：取5g鱼肉加入25mL 冷却的高氯酸(10g/100mL)，匀浆后3000×g离心10min 去沉淀，取上清液10mL，用1mol/L KOH调节pH值至6.5～6.8。静置15min 后于3000×g离心10min，取上清液，将其置于50mL容量瓶定容，溶液用0.45μm的水相滤膜过滤后，将其放置于－80℃冻藏用于后期检测。整个过程均在0～4℃条件下操作。ATP关联物高效液相色谱(HPLC)检测条件：色谱柱BDS C18(250mm×4.6mm)，以0.04mol/L磷酸二氢钾和0.06mol/L磷酸氢二钾混和液作为流动相进行平衡、洗脱。上样量1μL，流速1mL/min，柱温37℃，于254nm波长处检测。

式中：CHxR为肌苷含量/(μmol/g)；CHx为次黄嘌呤含量/(μmol/g)；CATP为腺嘌呤核苷三磷酸含量/(μmol/g)；CADP为腺嘌呤核苷一磷酸含量/(μmol/g)；CAMP为腺嘌呤核苷含量/(μmol/g)；CIMP为次黄嘌呤核苷含量/(μmol/g)。

质构分析：将美国红鱼片切成正方体，采用质构测定仪室温下测定。测定条件如下：每个样品进行两次轴向压缩，压缩百分比为50%，测试探头类型：P/50R，测前速率：1mm/s，测试速率：lmm/s，测后速率：1mm/s，探头2次测定间隔时间：5s，测定模式和选项：T.P.A，每次取不同鱼片重复测量3次，取平均值。

感官评分：由6名专业人员组成的感官评定小组进行，针对美国红鱼片的外观、气味、色泽、弹性4个方面为检验项目，以4个检验项目得分的平均值为鱼肉感官评分，如表1所示。

表1 美国红鱼片感官评分表Table 1 Sensory evaluation of red drum fillets

1.4 数据分析

实验重复2 次，每次各数据进行3 次重复测定(n=2×3)，通过肖维勒准则对可疑值进行剔除，采用Origin 7.5绘图，SPSS 11.0进行方差分析。P＜0.01为极显著，P＜0.05为显著。

2 结果与分析

2.1 美国红鱼片基本营养成分

美国红鱼片的水分含量为78.4%，粗脂肪含量为0.71%，粗蛋白含量高达19.03%，灰分含量为1.18%。与刘世禄等[3]测得的美国红鱼肌肉营养组成相似，显然，美国红鱼是一类高蛋白低脂肪的水产品，具有开发应用价值。

2.2 不同质量浓度壳聚糖涂膜对美国红鱼片细菌总数的影响

引起鱼类等水产品腐败变质的主要因素一般包括3种：微生物、酶促作用和化学变化，其中微生物是导致多数水产品腐败的主要因素，腐败微生物的生长状况可以反映出水产品的腐败程度。不同质量浓度壳聚糖涂膜的美国红鱼片在4℃冷藏时细菌总数变化如图1所示。美国红鱼片的初始细菌总数为3.69(lg(CFU/g))。按GB 2741—1994《海虾卫生标准》规定，细菌总数不大于105个/g为一级鲜度，不大于5×105个/g为二级鲜度，达到106～107个/g时，通常表明已极其腐败，不能食用，此时判定为货架期终点。根据标准规定，初始美国红鱼片为一级新鲜度，随着储藏时间的延长，对照组的细菌总数在第8天时为6.17(lg(CFU/g))，已经超过国家规定的卫生标准。而经过壳聚糖溶液涂膜处理的美国红鱼片细菌总数增长幅度低于对照组，根据1.0、1.5、2.0、3.0g/100mL壳聚糖处理后的细菌总数与贮藏时间的线性关系可知，它们分别于第11、13、14、13天时达到了6.0(lg(CFU/g))，超过了可食用标准。这说明贮藏过程中壳聚糖具有明显的抑菌效果，能够使鱼肉中腐败菌的生长受到抑制，保证了鱼肉的品质。整个贮藏过程中，2.0g/100mL组的抑菌效果最好，当壳聚糖质量浓度超过2.0g/100mL时，壳聚糖抑菌能力下降，这可能是由于壳聚糖质量浓度大、黏度过高而降低了其对细菌的抑制作用[12]。该结果与杨胜平等[13]采用不同质量浓度壳聚糖涂膜带鱼测定的细菌总数结果相似。

图 1 壳聚糖涂膜对冷藏美国红鱼片细菌总数的影响Fig.1 Effect of chitosan coating on TVC of red drum fillets stored at 4 ℃

2.3 不同质量浓度壳聚糖涂膜对美国红鱼片pH值的影响

图 2 壳聚糖涂膜对冷藏美国红鱼片pH值的影响Fig.2 Effect of chitosan coating on pH of red drum fillets stored at 4 ℃

动物肌肉的pH值变化与其鲜度密切相关，测定鱼肌肉pH值变化可以作为判定其鲜度的参考指标之一，通常而言，水产动物停止呼吸后，体内的糖原被降解，生成乳酸等酸类物质，造成肌肉pH值的下降，下降程度与肌肉中糖原的含量有关。随后在自身酶和微生物的作用下[14]，鱼体内的蛋白质、氨基酸及其他含氮物质被分解为氨、三甲胺、吲哚、组胺等碱性物质，使得肌肉pH值上升，因此肌肉的pH值变化趋势一般呈V字型。由图2可知，5组初始pH值为6.78，相互之间的pH值差别不大，说明壳聚糖处理并不影响鱼肉的初始pH值。5组的pH值在贮藏的前4d呈现明显的降低趋势，可能是因为鱼体死后迅速进入僵直阶段，其肌肉中的糖原经糖酵解途径产生乳酸，而使其肌肉pH值下降。随后5组的pH值都开始增加，对照组增加最为迅速，而壳聚糖处理后的4组的pH值增加相对缓慢。从整体上看，壳聚糖处理组中2.0g/100mL处理组pH值上升趋势平缓，且明显低于对照组(P＜0.05)。这与微生物测定结果相吻合，说明2.0g/100mL壳聚糖能够较好地保持美国红鱼的品质。

2.4 不同质量浓度壳聚糖涂膜对美国红鱼片TBA值的影响

TBA(硫代巴比妥酸)值与肉类脂肪氧化程度有很强的相关性，TBA值越大，说明脂肪的氧化程度越高，酸败就越严重，产生的小分子物质(醛、酮、酸等)越多，因此是广泛用于水产品、肉品品质评价中反应脂类氧化的一个常用指标[15]。它的反应原理是根据脂肪酸氧化降解产物丙二醛与TBA试剂反应生成稳定的红色化合物。不同质量浓度壳聚糖处理的美国红鱼冷藏过程中TBA值变化如表2所示。美国红鱼初始的TBA值很低，仅有0.072mg MDA/kg，贮藏期前4d时，5组样品的TBA值均略有升高，但之后其TBA值变化无显著差异(P＞0.05)，表现出无规律性。这可能是因为一方面美国红鱼的脂肪含量极低(仅为0.71%)，脂肪氧化反应不明显；另一方面也可能是因为脂肪氧化产物MDA还可以与核苷、核酸、蛋白质、磷脂氨基酸以及脂肪氧化的终产物醛类反应，从而使得MDA的量不能累积上升[16]。

表2 美国红鱼片在4℃贮藏过程中TBA值的变化Table 2 Changes in thiobarbituric acid (TBA) of red drum fillets during cold storage at 4 ℃mg MDA/kg

2.5 不同质量浓度壳聚糖涂膜对美国红鱼片TVB-N含量的影响

挥发性盐基氮(TVB-N)是指动物性食品在细菌和酶的作用下，分解蛋白质产生的氨以及胺类等碱性含氮物质。在许多肉类和鱼类中TVB-N水平和鲜度感官评定之间有很高的相关性，因此TVB-N被广泛作为反映肉类和鱼类腐败程度的最重要指标之一，已被我国和大多数国家作为鉴定肉类和水产品腐败程度的标准，30mg/100g被认为是水产品品质可被消费者接受的TVB-N上限[17]。不同质量浓度壳聚糖处理对美国红鱼TVB-N值的影响如图3所示。贮藏的前8d，5组TVB-N含量相互之间基本无差别，且都属于一级新鲜度的范畴。到第8天后，TVB-N含量开始迅速上升，在第16天时，除了2.0g/100mL壳聚糖处理组之外，其他4组的TVB-N含量都超过了可被接受的上限。经过显著性差异分析得到，经过壳聚糖处理的美国红鱼，2.0g/100mL壳聚糖处理组的TVB-N含量明显低于对照组(P＜0.05)，其TVB-N含量变化与细菌总数变化等有较好的相关性，说明适宜质量浓度的壳聚糖能有效抑制细菌的生长，从而降低细菌对蛋白质的分解，达到减缓TVB-N含量上升的作用。

图 3 壳聚糖涂膜对冷藏美国红鱼片TVB-N值的影响Fig.3 Effect of chitosan coating on TVB-N of red drum fillets stored at 4 ℃

2.6 不同质量浓度壳聚糖涂膜对美国红鱼片K值的影响

K值为肌苷(HxR)和次黄嘌呤(Hx)的含量总和与腺嘌呤核苷(ATP)代谢的含量总和的比值，一般鲜鱼肌肉的ATP含量为4～9μmol/g，死后ATP迅速分解成IMP、HxR和Hx。ATP降解速率与品种、死后时间、贮藏温度、运输条件和杀死方法有关[18]。K值越小就表示鱼的鲜度越好，K值越大则鲜度越差。从图4可以看出，随着冷藏时间的延长，K值呈现上升的趋势，其中上升最快的是对照组，最慢的是以2.0g/100mL壳聚糖涂膜处理的美国红鱼片。可见2.0g/100mL的壳聚糖能够有效的抑制ATP分解，从而有效延长美国红鱼低温贮藏的货架期。

图 4 壳聚糖涂膜对冷藏美国红鱼片K值的影响Fig.4 Effect of chitosan coating on K value of red drum fillets stored at 4 ℃

2.7 不同质量浓度壳聚糖涂膜对美国红鱼片质构的影响

鱼类等水产品在死后由于自身降解和微生物作用，使其鲜度降低并发生腐败，同时会引起肌肉组织结构的变化以及质构特性的变化，最终导致水产品肌体变软，弹性下降。质构特性包括硬度(hardness)、弹性(springiness)、咀嚼性(chewiness)、黏着性(adhesiveness)、凝聚性(cohesiveness)、胶性(gumminess)和回复性(resilience)等，是反映水产品品质的一个重要属性[19-20]。贮藏过程中各组处理样品质构特性(硬度、弹性和咀嚼性)的变化如表3所示。可以看出随着贮藏时间延长，各组样品的硬度呈现先增加而后开始下降，主要由于鱼体死后，体内糖原在无氧条件下产生乳酸，肌肉中ATP含量急剧下降而使肌肉收缩导致僵硬，当ATP消耗完全消失，鱼体变得最硬，肌肉僵硬结束，开始重新变软，进入“自溶”阶段。所以其硬度呈现先升高后降低的趋势。对于对照组，处理组的硬度下降趋势较平缓，且壳聚糖质量浓度为2.0g/100mL的硬度较好，同时从表3可以看出壳聚糖涂膜的美国红鱼的弹性及咀嚼性均优于对照组。表明适当质量浓度的壳聚糖涂膜能够有效抑制细菌增长，减缓鱼的氧化变质，保持和改善美国红鱼的质构品质。

表3 壳聚糖涂膜对冷藏美国红鱼片质构的影响Table 3 Changes in texture of red drum fillets stored at 4℃ by chitosan coating

2.8 不同质量浓度壳聚糖涂膜对美国红鱼片感官评分的影响

图 5 壳聚糖涂膜对冷藏美国红鱼片感官评分的影响Fig.5 Effect of chitosan coating on sensory scores of red drum fillets stored at 4 ℃

不同质量浓度壳聚糖涂膜对美国红鱼片感官的影响如图5所示。可以看出，随着贮藏时间的延长，红鱼片的感官评分逐渐下降。在实验开始时，所有实验组和对照组的评分都为10分，随着贮藏时间的延长，对照组的红鱼片感官评分明显下降，表现出肌肉组织松散，弹性变差，肉质黏稠，并带有臭味，其分值明显低于壳聚糖涂膜处理组。不同质量浓度壳聚糖涂膜的处理组感官评分也一直呈现下降趋势，质量浓度为2.0g/100mL的壳聚糖涂膜的美国红鱼片分值一直高于其他处理组。由此表明，壳聚糖涂膜能够有效抑制冷藏过程中美国红鱼片体内微生物的生长繁殖速度，从而较好的保持了其感官品质。

3 结 论

实验结果表明，经过壳聚糖涂膜的美国红鱼片在冷藏过程，其细菌总数、pH值、TBA值、TVB-N含量和K值等指标明显低于对照组，感官评分也具有较好的效果。且当壳聚糖质量浓度为2.0g/100mL时，能较好地抑制细菌生长，减缓蛋白质分解和脂肪氧化的速度，有效延长美国红鱼片货架期4～6d，因此壳聚糖涂膜在美国红鱼片的冷藏保鲜中具有良好的应用前景。

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