玉米皮阿魏酰低聚糖酯体外抗氧化能力

黄汝清，何蓉蓉，欧仕益,*

(1.暨南大学食品科学与工程系，广东 广州 510632；2.暨南大学中药及天然药物研究所，广东 广州 510632)

玉米是我国主要的粮食作物之一，主要用于生产玉米淀粉、玉米酒精、玉米油及玉米糖等[1]。玉米皮是生产淀粉的主要副产物，约占玉米原料的10%～14%[1]。目前玉米皮主要用作饲料，未得到充分利用。玉米皮含有大量膳食纤维和酚类物质，其中总阿魏酸含量约为3%[2]，主要通过酯键与细胞壁多糖或木质素交联[3]，是制备阿魏酰低聚糖酯的理想原料。

自由基可诱发癌症、糖尿病、心血管疾病，自身免疫疾病、神经退行性病变等，抗氧化剂能预防或改善这些疾病的发生风险[4]。阿魏酸是一种良好的抗氧化剂，它具有抗血栓、预防动脉粥样硬化、心脏病、抗菌消炎等功能，日本已批准用作食品抗氧化剂，我国和美国可用于功能性食品[5]。阿魏酰低聚糖酯是低聚糖的糖羟基与阿魏酸羧基酯化形成的一类化合物，水溶性优于阿魏酸；由于它具有阿魏酸结构，预示其具有抗氧化功能，本实验对玉米皮制备的阿魏酰低聚糖酯进行清除自由基和测定还原力和抗氧化能力指数的实验，探讨阿魏酰低聚糖酯的抗氧化能力，为其可用作功能性成分提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米皮购自长春大成集团有限公司。

淀粉酶、蛋白酶 诺维信(中国)生物技术有限公司；阿魏酸、蛋氨酸 广州市齐云生物技术公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美国Sigma公司；氯化硝基四氮唑蓝 中国前进化学试剂厂；核黄素 上海化学试剂站分装厂；2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐(AAPH)、 6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸(Trolox)、荧光素钠 日本和光纯药株式会社；所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

不锈钢手提式压力蒸汽灭菌器 合肥华泰医疗设备有限公司；UV-9600紫外-可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司；HH-4恒温水浴锅 江苏金坛市宏体仪器厂；LC-20AT液相色谱仪 日本Shimadzm公司；ICS-2500离子色谱仪 美国Dionex公司；KDC-12低速离心机 科大创新股份有限公司中佳分公司；Genios多功能荧光酶标仪 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 阿魏酰低聚糖酯的制备

利用淀粉酶、蛋白酶去除玉米皮中的淀粉和蛋白质，制得去淀粉去蛋白玉米皮[6]。称取50g去淀粉去蛋白玉米皮，按1：10(m/V)加入6g/L的草酸溶液，置蒸汽灭菌器中121℃蒸煮20min，冷却后过滤，收集滤液。用Amberlite XAD-2树脂吸附滤液，分别用去离子水和50%(体积分数)乙醇水溶液进行洗脱，收集乙醇水洗脱液，浓缩，冷冻干燥得阿魏酰低聚糖酯[7-8]。

1.3.2 原料与阿魏酰低聚糖酯成分测定

去淀粉去蛋白玉米皮中阿魏酸含量参照欧仕益等[9]的方法测定。由于阿魏酰低聚糖酯暂无标准品，通常以阿魏酰低聚糖酯中阿魏酸含量来表示样品的含量，测定方法参照王远[10]的方法；样品总糖含量的测定按文献[11]进行；样品的单糖组分测定参照李国强等[12]的方法。并对样品进行液相色谱-质谱联用(LC-MS)分析。

1.3.3 阿魏酰低聚糖酯对·OH的清除能力[13]

于10mL具塞比色管中依次加入2mL不同浓度的阿魏酰低聚糖酯溶液、0.5mL 9mmol/L 水杨酸-乙醇溶液、0.5mL 9mmol/L氯化亚铁溶液、6.5mL去离子水和0.5mL 8.8mmol/L过氧化氢溶液，混匀后，置37℃水浴中反应1h。反应结束后在波长510nm处测定吸光度。以阿魏酸为对比物质。·OH的清除率按式(1)计算。

式中：A样品为样品溶液的吸光度；A对照为去离子水代替氯化亚铁溶液的吸光度；A空白为去离子水代替样品溶液测定吸光度。

1.3.4 阿魏酰低聚糖酯对DPPH自由基的清除能力[14]

于试管中加入2mL不同浓度的阿魏酰低聚糖酯溶液和2mL 0.5mmol/L的DPPH溶液(以95%乙醇配制)，混匀后，室温下避光反应30min。反应结束后在波长517nm处测定吸光度。以阿魏酸作为对比物质。DPPH自由基的清除率按式(2)计算。

式中：A样品为样品溶液的吸光度；A对照为95%乙醇代替DPPH的吸光度；A空白为去离子水代替样品溶液的吸光度。

1.3.5 阿魏酰低聚糖酯对O2－·的清除能力[15]

于试管中加入0.4mL不同浓度的阿魏酰低聚糖酯溶液、0.4mL 0.5mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.8)、0.4mL 0.13mol/L蛋氨酸、0.4mL 2×10-5mol/L核黄素、0.4mL 7.0×10-4mol/L氯化硝基四氮唑蓝和1mL去离子水，混匀后，光照20min，以黑暗终止反应。反应结束后在波长560nm处测定吸光度。以阿魏酸作为对比物质。O2－·的清除率按式(3)计算。

式中：A样品为样品溶液的吸光度；A对照为不进行光照的实验组的吸光度；A空白为去离子水代替样品溶液的吸光度。

1.3.6 阿魏酰低聚糖酯还原力测定[16-17]

于试管中依次加入1mL不同浓度的阿魏酰低聚糖酯溶液、2.5mL 0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH6.6)和2.5mL 1%铁氰化钾，混匀后，置50℃水浴避光反应20min；再加入2.5mL 10%三氯乙酸溶液终止反应，离心10min。吸取2.5mL上清液，加入2.5mL去离子水、0.5mL 0.1%三氯化铁溶液，混匀后，室温下反应10min。反应结束后在波长700nm处测定吸光度。以阿魏酸作为对比物质。

1.3.7 阿魏酰低聚糖酯抗氧化能力指数测定[18-20]

于96孔板的微孔中加入20μL不同浓度的阿魏酰低聚糖酯溶液、20μL 75mmol/L磷酸钾缓冲溶液、140μL AAPH(至终浓度为12.8mmol/L)和20μL荧光素钠(至终浓度为63nmol/L)，置37℃的荧光酶标仪中开始测定。每2min测定一个点，至荧光强度衰减为零为止。以缓冲溶液代替AAPH(－AAPH)和以缓冲溶液代替抗氧化剂(+AAPH)作两个对照组。以阿魏酸作为对比物质。抗氧化能力指数(ORAC)是以20μmol/L的Trolox在荧光衰退曲线下对应的保护积分面积作为标准对照计算。

式中：S为荧光衰退曲线下的面积；c为试剂或样品浓度。

2 结果与分析

2.1 原料与阿魏酰低聚糖酯的成分

按1.3.2节的方法测得，去淀粉去蛋白玉米皮中阿魏酸含量为2.70%。冻干获得的阿魏酰低聚糖酯中阿魏酸含量为4.88%，总糖含量为93.94%，样品中单糖组分包括阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖，相对百分含量依次为10.22%、3.67%、28.65%和57.46%。阿魏酰低聚糖酯的液质联用总离子流图如图1所示。色谱峰A信号最强，在它对应的质谱图中，正离子模式下m/z 349.4[M+Na+]，负离子模式下m/z 325.4[M－H+]，两者可共同推断出该色谱峰对应成分的相对分子质量为326。相关研究发现相对分子质量为326的玉米皮阿魏酰低聚糖酯，其结构是阿魏酰阿拉伯糖酯[21]。

图 1 阿魏酰低聚糖酯的液质联用总离子流图Fig.1 Total ion current chromatogram of feruloylated oligosaccharides by LC-MS

2.2 阿魏酰低聚糖酯对·OH的清除能力

图 2 阿魏酰低聚糖酯和阿魏酸对·OH的清除率Fig.2 Comaprative evaluation of hydroxyl free radical scavenging feruloylated oligosaccharides and ferulic acid

Fe2+和H2O2反应生成的·OH，与水杨酸结合产生紫色物质；若加入抗氧化剂清除·OH，可减少紫色物质的生成量，通过测定吸光度来计算抗氧化剂对·OH的清除率。由图2可知，在1～10mmol/L范围内，阿魏酰低聚糖酯和阿魏酸对·OH的清除能力均随着样品浓度的升高而逐渐增强；相同浓度条件下，阿魏酰低聚糖酯的·OH清除率明显大于阿魏酸，说明阿魏酰低聚糖酯对·OH的清除能力优于阿魏酸。

2.3 阿魏酰低聚糖酯对DPPH自由基的清除能力

图 3 阿魏酰低聚糖酯和阿魏酸对DPPH自由基的清除率Fig.3 Comaprative evaluation of DPPH radical scavenging capacity of feruloylated oligosaccharides and ferulic acid

DPPH自由基是一种稳定的有机氮自由基，溶液呈深紫色，抗氧化剂与DPPH自由基反应使溶液颜色变浅，通过测定吸光度可衡量抗氧化剂对DPPH自由基的清除能力。由图3可知，阿魏酰低聚糖酯具有显著的清除DPPH自由基效果。在浓度小于0.6mmol/L时，阿魏酰低聚糖酯对DPPH自由基的清除率随着浓度的增大而增大；当浓度达到0.6mmol/L后，清除率变化趋于平稳，阿魏酸亦表现出类似的变化趋势。当浓度为2mmol/L时，阿魏酰低聚糖酯对DPPH自由基的清除率为93.80%，说明阿魏酰低聚糖酯具有良好的清除DPPH自由基的能力。

2.4 阿魏酰低聚糖酯对O2－·的清除能力

图 4 阿魏酰低聚糖酯和阿魏酸对O2－·的清除率Fig.4 Comaprative evaluation of superoxide anion free radical scavenging activity of feruloylated oligosaccharides and ferulic acid

蛋氨酸和核黄素在光照下产生的O2－·，与氯化硝基四氮唑蓝反应生成蓝紫色物质，抗氧化剂可减少蓝紫色物质的产生[22]，因此通过测定吸光度变化可评价抗氧化剂对O2－·的清除效果。由图4可知，阿魏酰低聚糖酯对O2－·的清除能力存在浓度依赖关系，变化趋势与对·OH的清除作用相似。在低浓度(＜3mmol/L)时，阿魏酰低聚糖酯的清除能力比阿魏酸的更为显著，随着浓度升高，阿魏酰低聚糖酯的清除率增长速度减慢。当浓度达到5mmol/L时，阿魏酰低聚糖酯对O2－·的清除率达到98.05%，阿魏酸的清除率为75.96%，阿魏酰低聚糖酯的清除效果极佳。

2.5 阿魏酰低聚糖酯的还原力

图 5 阿魏酰低聚糖酯和阿魏酸的还原力Fig.5 Comaprative evaluation of reducing power of feruloylated oligosaccharides and ferulic acid

抗氧化剂与铁氰化钾反应，将后者还原为亚铁氰化钾，生成的亚铁氰化钾再与Fe3+反应生成亚铁氰化铁，通过测定吸光度来评价抗氧化剂的还原能力，吸光度越大，还原能力越强。由图5可知，低浓度时，阿魏酰低聚糖酯和阿魏酸的还原力比较接近，随着浓度的升高，吸光度逐渐增大，两者的还原力逐渐增大，且前者的还原力比后者强，增长速度更快。当浓度为1mmol/L时，阿魏酰低聚糖酯的还原力约为阿魏酸的1.7倍。表明阿魏酰低聚糖酯是良好的供电子体，对Fe3+有良好的还原能力。

2.6 阿魏酰低聚糖酯抗氧化能力指数

图 6 阿魏酰低聚糖酯和阿魏酸荧光衰退曲线Fig.6 Fluorescence decay curves of feruloylated oligosaccharides and ferulic acid

AAPH产生的自由基可使荧光素钠发生荧光淬灭，加入抗氧化剂则可延缓荧光淬灭速度。由图6可知，与荧光自然衰退曲线相比，阿魏酰低聚糖酯和阿魏酸均表现出了延缓荧光衰减速度的能力。计算得阿魏酸的ORAC值为2.62μmol Trolox/μmol，阿魏酰低聚糖酯的ORAC值为4.77μmol Trolox/μmol，约为前者的1.8倍。说明相同浓度的阿魏酰低聚糖酯比阿魏酸具有更高的抗氧化能力。

3 结 论

研究了玉米皮阿魏酰低聚糖酯的体外抗氧化能力，结果显示，阿魏酰低聚糖酯对·OH、DPPH自由基和O2－·均具有良好的清除能力，尤其对DPPH自由基和O2－·的清除能力最为显著，最高清除率可达90%以上。样品的还原力和抗氧化能力指数都优于阿魏酸的测定结果，分别为阿魏酸的1.7倍和1.8倍。

阿魏酰低聚糖酯具有抗氧化性质，这主要与其中的阿魏酸结构有关，酚羟基是主要的抗氧化基团。阿魏酰低聚糖酯表现出比阿魏酸更高的抗氧化能力，原因可能与阿魏酰低聚糖酯中的低聚糖结构有关，有研究发现大豆低聚糖具有抗氧化作用[23]。低聚糖结构可能使得阿魏酸水溶性提高，扩大了阿魏酰低聚糖酯的应用范围。

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