人精液抗菌多肽29肽的分离纯化及活性研究分析

喻志勇

云南省西双版纳州人民医院外二科,云南西双版纳666100

抗菌肽又称抗生素肽,对生物生存价值很高,对生物细胞的杀菌活性很高,且对于正常细胞无不良作用,通过从生物体内进行提取,可以在临床医学中发挥重要的价值.据研究来自人体的抗菌肽较之其他生物体中提取的抗菌肽,具有明显的优越性,不会发生严重的免疫反应,同样可以应用到临床中,现已鉴别到在人的静夜中含有40多种抗菌多肽,29肽据推测是一种新型的防御素,如果能进行科学提取,并分离纯化,将在临床发挥重要作用[1].该文即对人精液抗菌肽29肽的分离纯化以及活性进行了探讨研究,下面对该院2009-2011年所得实验研究结果具体报道如下.

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 精液标本在4℃下离心对精液去沉渣,取出上部分精液,并冷冻于零下26℃的环境中.精子的活性以及WBC均符合正常标准.

1.1.2 菌株与试剂菌株:金黄色葡萄菌、酵母菌、绿脓杆菌、大肠杆菌以及白色念珠菌.试剂:PBS、蛋白质、琼脂糖、酵母提取物、三氧一酸以及水等.

1.1.3 仪器液相层析系统,主要包括:例子交换色谱、分子筛、精子分析仪、冷冻离心机、冻干机、分离阳离子柱系统.

1.2 分离纯化方法

①对人精液提取抗菌肽粗品,并冷冻进行保存.②阳离子交换柱进行层析.将已经冻干的精液活性干粉,溶解于阳离子交换柱进行洗脱,并用收集器收集洗脱峰,低温干燥冷冻保存,然后稀释进行抑菌试验,具有抑菌性的洗脱峰即为含抗菌肽的峰.③凝胶过滤:将含有抑菌肽的洗脱峰干峰合并后溶解,使用0.45 mm膜对上柱进行过滤,并再次进行洗脱、收集并冷冻保存,稀释进行抑菌试验,确定含有抗菌肽的峰.④将凝胶过滤柱检测有活性的洗脱峰再度洗脱,高压液相反相色谱仪检测波长为215 mm.将洗脱液1mL管进行收集并干燥冷冻保存,然后稀释进行抗菌试验.

1.3 活性检测

①分别对以上各步进行分离纯化的含抗菌肽提取物的最低抑菌浓度、抗菌谱进行检测.②使用琼脂糖弥散法对不同浓度29肽的抗菌活性进行检测分析.③对抗菌肽溶血活性进行检测.

2 结果

2.1 含抗菌肽提取物的最低抑菌浓度、抗菌谱检测

抗菌肽的提取物对金黄色葡萄菌、酵母菌、绿脓杆菌、大肠杆菌以及白色念珠菌分别均有程度不同的抑制作用,对其最低抑菌浓度以及抗菌谱进行检测.杀菌活性整体要优于抗生素,对杀菌活性从低到高进行排序,结果为:大肠杆菌(10.5 ug/mL)、绿脓杆菌(18.8 ug/mL)、金黄色葡萄菌(20.9 ug/mL)、酵母菌(37.1 ug/mL),以及白色念珠菌(41.8 ug/mL).具体结果见表1.

表1 含抗菌肽提取物的最低抑菌浓度、抗菌谱检测结果

2.2 琼脂糖弥散法对不同浓度29肽的抗菌活性的检测分析

经分析,29肽对真菌均的抑制作用很强;对G+的抑菌活性要大于对G-的抑菌活性,由统计知,对绿脓杆菌的抑制活性相对最强,对酵母菌和白色念珠菌的抑制活性相对较弱.见表2.

表2 琼脂糖弥散法对不同浓度29肽的抗菌活性的检测分析结果

2.3 抗菌肽的溶血活性的检测结果

将人精液中抗菌肽的提取物进行配制,浓度为2 mg/mL,加入20 uL 29肽,并取1mL红细胞使用EP管加入其中.经检测显示,抗菌肽溶血活性均呈现阴性,说明29肽不具有溶血活性.

3 讨论

抗菌肽是一种具有天然免疫功能的重要介质,是效果明显的体液免疫物质,人体的粘膜正是微生物细菌的重要侵入通道,因此,抗菌肽对于增强人体的免疫功能具有重要作用.同时,男性的生殖系统也是一种具有天然免疫功能的场所,已经鉴定的抗菌肽多达40多种,如果能采用科学合理的方法予以分离提取并进行纯化后使用,对于临床医学将产生很重要的价值.

在分离提纯中,需要进行细致的多重步骤,该文提纯先对人精液先予以粗品提制,并进行冷冻保存,然后将冷冻的精液干粉进行溶解,分别进行阳离子交换柱进行层析、凝胶过滤等,将溶解的精液干粉予以洗脱,并用收集器收集洗脱峰,低温干燥冷冻保存,然后稀释进行抑菌试验,具确定具有抑菌性的洗脱峰为含抗菌肽的峰.对于抗菌肽提取物还需进一步进行活性检测,以选取出抑菌活性强的抗菌肽,在应用于临床时,能发挥最佳功效.

该文分别对含抗菌肽的提取物进行最低抑菌浓度、抗菌谱进行检测,并采用琼脂糖弥散法对不同浓度29肽的抗菌活性的检测分析,同时对抗菌肽提取物的溶血活性予以检测.经检测分析知,最低抑菌浓度、抗菌谱检测:杀菌活性整体要优于抗生素.其中,大肠杆菌(10.5 ug/mL)>绿脓杆菌(18.8 ug/mL)>金黄色葡萄菌(20.9 ug/mL)>酵母菌(37.1 ug/mL)>白色念珠菌(41.8 ug/mL).琼脂糖弥散法对不同浓度29肽抗菌活性的检测分析:29肽对真菌均的抑制作用很强;对G+的抑菌活性要大于对G-的抑菌活性,对绿脓杆菌的抑制活性相对最强,对酵母菌和白色念珠菌的抑制活性相对较弱.菌肽的溶血活性的检测:抗菌肽溶血活性均呈现阴性,说明29肽不具有溶血活性.

由以上统计可知,抗菌肽抗菌能力很强,较之抗生素明显要具有优势.其中,29肽初步确定为一种新型的生物活性多肽,是一种新型的防御素.该文使用的精液中提取纯化的29肽是一种阳离子抗菌肽,对多种微生物病源具有很强的抑制能力,且对真菌的抑制力很强.研究分析显示,29肽的抗菌活性和其浓度有着重要关系,浓度高则抗菌活性强,反之,则相对较弱.如果能应用临床,应根据不同浓度29肽的抗菌活性能力予以合理选取.另外,29肽对于G+的抑制效果比较明显,而当前临床上针对G+菌和真菌的药物均很少,且目前使用的药物容易出现耐药性反应.29肽的出现克服了旧有药物的弊端,对于当前呈上升趋势的性病,以及生殖系统感染疾病将有很好的治疗作用.

当前将29肽应用于医学临床,还存在一定问题,最主要的是29肽容易与蛋白酶发生作用,并被蛋白酶所消化.不过,当前在肿瘤病人的口腔黏膜炎治疗中,已经开始使用抗菌肽类药物,临床效果十分明显.对于29肽的应用,应继续研究探讨,以争取能克服应用问题,使29肽尽快在临床上发挥其重要的抗菌作用.

[1]周惠民.人精液抗菌多肽29肽的分离纯化与活性分析[J].中国当代医药,2010(2):435-437.

[2]孙少阳.人精液抗菌多肽29肽的活性分析[D].重庆:西南大学,2010.

[3]郑大伟.人精液抗菌多肽的克隆与活性分析[D].合肥:安徽医科大学,2009.

[4]曹素江,沈怀仁,仇辉光.人精液抗菌多肽29肽的纯化及活性研究[J].临床医学杂志,2004(6):26-29.