OCT4介导肝细胞去分化过程中巢蛋白的表达及意义探讨

李 冰，郭恩凯，郝好杰，申 晶，程 愈，韩为东，母义明

解放军总医院，北京 100853 1内分泌科；2分子生物学实验室

糖尿病是对人类健康威胁最为严重的疾病之一，现行的口服药物和胰岛素治疗容易造成血糖波动，不能从根本上治疗糖尿病[1]。因此人们开始寻求β细胞替代治疗的新来源。已有实验将胰腺发育的关键转录因子如Pdx-1等直接导入肝细胞中使之转变为胰岛素分泌细胞(insulin producing cell，IPC)，但效率较低，产生的IPC功能不完善[2-4]。OCT4是维持胚胎干细胞多潜能性和自我更新能力的干性基因之一，有实验证实单独OCT4可使成体细胞去分化以实现细胞的重编程，如成纤维细胞向造血前体细胞的转变[5-7]。Nestin是多谱系前体细胞的标志物之一[8]。不同来源的巢蛋白(nestin)阳性细胞可体外诱导为神经细胞、平滑肌细胞、肝细胞以及胰腺内外分泌细胞[9-10]等。本实验拟探索肝细胞先经去分化再向IPC诱导的重编程路径，通过观察nestin在肝细胞经OCT4介导的去分化过程中的表达，为选择合适的诱导时机提供参考和依据。

材料和方法

1 实验材料 6~8周雄性C57BL/6小鼠从本院动物中心引进，饲养在无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级动物房内。包装慢病毒所用的pwpt-GFP、psPAX2、p MDay2G质粒由第二军医大学细胞生物教研室胡以平教授提供，pwpt-OCT4质粒由本实验室构建，293T细胞由本实验室提供。肝细胞培养液购自ScienCell公司。高糖DMEM、Opti-MEM、RPMI Medium 1640、Knockout血清、非必需氨基酸(nonessential aminoacid，NEAA)、谷氨酰胺(L-glutamine)、β巯基乙醇(b-mercaptoethanol)、RNA提取试剂Trizol、Complete F12 Medium购自Invitrogen公司。胶原酶Ⅳ购自Sigma公司。碱性成纤维生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)购自Peprotech公司。反转录试剂盒购自Famantas公司。……