空间环境诱导屎肠球菌突变株LCT-EF18的蛋白组学分析

常 德，刘进文，方向群，李天志，王俊锋，郭英华，徐国纲，苏龙翔，姜学革，刘 岩，王雅娟，陈振鸿，王 立，刘长庭

1解放军总医院 南楼呼吸科，北京 100853；2深圳华大基因研究院，广东深圳 518083

随着我国载人航天事业的发展和空间站建设计划的实施，航天医学保障日益重要。在航天活动中，航天员体内微生物可随航天员进入太空，微重力、强辐射、弱磁场和极端温度等特殊空间环境可影响微生物的生物学特性，诱导细菌致病性改变，使航天员的感染风险增加[1-2]。屎肠球菌是一种革兰氏阳性菌，属于肠球菌属，是人类胃肠道的常驻菌群[3-4]，是哺乳动物胃肠道内无害的共生菌[5]，被用作为益生菌加入到发酵食品中[6]。然而，某些肠球菌已被确认为能引起感染的条件致病菌[7-8]，可导致人体多系统感染。为了解空间环境对屎肠球菌生物学特性的影响，本研究以神舟八号飞船搭载的屎肠球菌为研究对象，筛选空间环境诱导的屎肠球菌突变株，并通过差异蛋白学研究空间环境诱导突变株出现的差异表达蛋白质，分析空间环境因素对屎肠球菌的影响机理，为保障航天员的健康和在轨安全提供理论基础。

材料和方法

1 材料 屎肠球菌购自中国菌种保存中心，保藏号为CGMCC1.2136，表型筛选Biolog生化反应板GEN III MicroPlate TM来自美国Biolog公司，蛋白浓度测定BCA试剂盒购自美国Thermo fish公司，iTRAQ试剂盒购自美国ABI公司。

2 空间环境诱导屎肠球菌突变株的筛选 神舟八号飞船返回地面后，取出搭载的屎肠球菌，在LB琼脂平板上划线培养，挑选单克隆菌株接种在LB液体培养基中，培养24 h后取2 ml菌液6 000 r/s离心5 min，弃上清，用0.9%氯化钠注射液洗涤菌体，6 000 r/s离心5 min，弃上清后用Biolog接种液进行悬浮菌体，浓度107~108，震荡均匀，向每个Biolog板孔加样100μl，共96孔，放置在37℃下培养，24 h和48 h进行观察。

3 总蛋白提取、烷基化处理和浓度测定 总蛋白裂解液：50 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，0.5% Triton X-100，pH值8.5~9.0；用前加入100μg/ml溶菌酶、1μl/ml的蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)。12 000 g，4℃下离心菌液15 min收集菌体，用PBS悬浮洗涤2遍，加入1 ml配制好的裂解液悬浮菌体；采用300 W、10 s超声，间隔10 s，超声20 min后，1 000 g/min离心去掉大碎片，进行还原烷基化处理，打开二硫键充分酶解蛋白。根据BCA试剂盒说明书，按2 000μg、1 000μg、500μg、250μg、125μg、62.5μg、31.25μg、0μg的标准品蛋白量加入微孔板，每种浓度设三个复孔，同时样品蛋白按照不同量加入微孔板，各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30 min后，在562 nm下测定管吸收值，绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品蛋白浓度，并进行SDS-PAGE电泳检测。

4 同重同位素相对与绝对定量(isobaric tags for relativeand absolute quantitation，iTRAQ)定量蛋白质组学实验 根据iTRAQ定量蛋白质组分析试剂盒说明，加入蛋白酶，使蛋白消化成不同的肽段，用iTRAQ试剂标记肽段，并进行等量混合，使用强阳离子交换色谱(strong cation exchange choematography，SCX)进行预分离。最后进行液相串联质谱(liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析。

5 蛋白质鉴定 通过iTRAQ定量分析的一级谱图和二级拼图，分别鉴定肽段和蛋白质数量，通过比对地面对照屎肠球菌基因组测序注释到的蛋白质，每种样品重复3次，绘制3次重复之间鉴定到的蛋白质重叠图，并分析肽段序列长度分布、肽段序列覆盖度和肽段数量分布。以3次重复之间有2次或以上重复鉴定到的蛋白质确定为最终鉴定到的蛋白质，并进行下一步的蛋白质定量分析。

6 蛋白质定量分析 在iTRAQ定量分析中，当蛋白质定量值满足下面两个条件，视为单次重复间的差异蛋白；在3次重复中至少2次重复达到以下要求时，视为最终差异蛋白。1)蛋白丰度差异倍数超过1.2倍以上；2)经多重假设检验P＜0.05。同时分析蛋白质丰度比分布，在相对定量时如果同一个蛋白质的量在两个样品间没有显著变化，那么其蛋白质丰度比接近于1。当蛋白丰度比即差异倍数达到1.2倍以上，且经假设检验P＜0.05，视该蛋白为不同样品间的差异蛋白。对每个蛋白质差异倍数以2为底取对数后作出分布。

7 差异蛋白注释分析 当蛋白的丰度比即差异倍数＞1.5倍，且经多重检验P＜0.05，视该蛋白为空间组和地面对照组间的差异蛋白。把所有差异蛋白质向Gene Ontology数据库的各个条目映射，计算每个条目的蛋白质数目，应用超几何检验找出与所有蛋白质背景相比在差异蛋白质中显著富集的GO条目。

结 果

1 空间环境诱导屎肠球菌突变株的筛选 采用Biolog生化反应板筛选到空间环境诱导的屎肠球菌LCT-EF18突变株，LCT-EF90菌株为地面对照屎肠球菌菌株，Biolog反应板上3个孔显示出不同的颜色反应，见图1，分别是空间诱变株能利用底物肌酐和L-苹果酸，而不能利用对羟基苯乙酸(表1)，表明经过太空飞行后得到的LCT-EF18发生了生物学性状的改变。

2 总蛋白提取和蛋白质浓度测定 提取总蛋白并进行烷基化处理后，利用BCA试剂盒测定蛋白浓度，从标准品BSA浓度为横坐标，562 nm波长的光吸收值为纵坐标绘制标准曲线，曲线的R方值为0.990 3，表明浓度和光吸收值间的线性关系较好(图1)，从而推算出蛋白浓度的计算公式为X=(Y-0.213 7)/0.001 2。将样品变形后进行SDSPAGE电泳检测(图2)。

3 蛋白质鉴定 3次重复都包括的有1 027个蛋白，2次重复均鉴定到的有425个蛋白，其鉴定到1 452个蛋白质(图3)，肽段序列长度分布在10个氨基酸左右，80%的蛋白质肽段序列覆盖度超过10%，覆盖11个肽段的蛋白数量在590个以上。

4 蛋白质定量分析 同地面对照组相比，空间环境诱导突变株出现50个蛋白表达上调，74个蛋白质下调(图4)。蛋白质丰度分布见图5，横坐标表示差异倍数经过以2为底数的对数转化后的值，＞0为表达量上调，＜0为表达量下调。

5 差异蛋白的GO功能注释分析 GO功能总共有三个本体(ontology)，分别描述基因的分子功能(molecular function)、所处的细胞位置(cellular component)、参与的生物过程(biological process)，表明空间环境能影响屎肠球菌能量代谢、核苷酸合成和大分子的催化，此类差异表达蛋白参与的生物过程见表2。

图1 用于蛋白定量的标准曲线Fig. 1 Standard curve for quantifying protein concentrations

图2 屎肠球菌菌株总蛋白SDS-PAGE电泳检测Fig. 2 SDS-PAGE of total protein in E. faecium strain

图3 三次重复之间鉴定到的蛋白质重叠图Fig. 3 Overlap of identified proteins among 3 replications

图4 差异蛋白数量统计Fig. 4 Number of different proteins

图5 蛋白质丰度分布(LCT-EF20和LCT-EF90)Fig. 5 Protein distribution detected by LCT-EF20-VS-LCT-EF90

表1 LCT-EF20和LCT-EF90菌株的底物利用差异Tab. 1 Different utilization of substrates between LCTEF20 and LCT-EF90

表2 差异蛋白的GO富集分析Tab. 2 Gene ontology enrichment analysis of different proteins

讨 论

空间站上最大的微生物库是航天员肠内的常驻菌群，过去关于微重力对细菌致病性的影响多集中在沙门氏菌和大肠杆菌。将暴露于模拟微重力环境或真实空间环境的沙门氏菌感染小鼠后，其感染后的死亡率与对照组相比明显增加[9-10]。因此，开展空间环境因素对病原菌的作用效应和机理研究意义重大。

屎肠球菌早期被认为属于D群链球菌属[11]，随着分子生物学各项技术的发展，通过基因DNA的同源性检测，发现其属于肠球菌属。肠球菌是人体内的一种正常菌群，但在人体免疫力下降时同样可以致病，因此是一种条件性致病菌，常可导致多个系统发生感染，例如人体生殖系统、泌尿系统、腹腔感染、伤口表面感染等，同时也是引起院内感染的常见菌群之一[2,7]。

本研究利用Biolog生化反应筛选搭载神舟八号飞船飞行的屎肠球菌突变株，通过最新一代的质谱技术对屎肠球菌空间突变株进行蛋白组学分析，鉴定经过太空飞行后的发生表达改变的屎肠球菌蛋白，我们发现有124个蛋白质表达的改变，其中包括50个表达增加的蛋白和74个表达下调的蛋白，经过GO功能的注释分析发现这些蛋白主要参与大分子催化、ATP 生物合成、嘌呤核苷生物合成、ATP代谢和嘌呤核苷酸生物合成等过程，这些主要同细菌的能量和物质代谢有关，也可能同细菌致病性和耐药性相关。我们后续将进一步研究这些表达改变的蛋白质功能，尤其是同细菌致病力相关的蛋白。

1 Franz CM， Holzapfel WH， Stiles ME. Enterococci at the crossroads of food safety?［J］. Int J Food Microbiol， 1999， 47（1-2）： 1-24.

2 Stiefel U， Donskey CJ. The role of the intestinal tract as a source for transmission of nosocomial pathogens［J］. Clin Infect Dis， 2004， 6（6）： 420-425.

3 Horneck G， Klaus DM， Mancinelli RL. Space microbiology［J］.Microbiol Mol Biol Rev， 2010， 74（1）：121-156.

4 Rosenzweig JA， Abogunde O， Thomas K， et al. Spaceflight and modeled microgravity effects on microbial growth and virulence［J］.Appl Microbiol Biotechnol， 2010， 85（4）：885-891.

5 Lund B， Edlund C. Probiotic enterococcus faecium strain is a possible recipient of the vanA gene cluster［J］. Clin Infect Dis， 2001， 32（9）：1384-1385.

6 Franz CM， Stiles ME， Schleifer KH， et al. Enterococci in foods--a conundrum for food safety［J］. Int J Food Microbiol， 2003， 88（2-3）：105-122.

7 Moellering RC Jr. Emergence of enterococcus as a significant pathogen［J］. Clin Infect Dis， 1992， 14（6）： 1173-1176.

8 Murray BE. The life and times of the Enterococcus［J］. Clin Microbiol Rev， 1990， 3（1）：46-65.

9 Wilson JW， Ott CM， Höner zu Bentrup K， et al. Space flight alters bacterial gene expression and virulence and reveals a role for global regulator Hfq［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2007， 104（41）：16299-16304.

10 Wilson JW， Ramamurthy R， Porwollik S， et al. Microarray analysis identifies Salmonella genes belonging to the low-shear modeled microgravity regulon［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2002， 99（21）：13807-13812.

11 Jayarao BM， Doré JJ Jr， Oliver SP. Restriction fragment length polymorphism analysis of 16S ribosomal DNA of Streptococcus and Enterococcus species of bovine origin［J］. J Clin Microbiol， 1992，30（9）： 2235-2240.