空间诱导蜡状芽孢杆菌LCT-BC25和LCT-BC235的蛋白质组学研究

苏龙翔，刘进文，方向群，李天志，王俊峰，郭英华，常 德，徐国纲，刘长庭

1解放军总医院 南楼呼吸科，北京 100853；2南开大学医学院，天津 370071；3深圳华大基因研究院，深圳 518083

蜡样芽胞杆菌是革兰氏阳性杆菌，好氧或兼性厌氧并能形成孢子，是一种条件致病菌，能产生三种不同的肠毒素，引起呕吐综合征和腹泻[1-3]。宇宙空间站中普遍存在蜡状芽孢杆菌，宇航员的食物容易受到蜡状芽孢杆菌的污染[4]。因此研究空间诱变的蜡状芽孢杆菌对空间驻留人员的健康具有重要意义。本研究利用神州八号飞船实验平台搭载蜡状芽孢杆菌进行实际天基实验，对返回地面后的菌株进行了蛋白质组检测，以期发现空间环境对蜡状芽孢杆菌的影响。

材料和方法

1 菌株选择 蜡状芽孢杆菌来源于中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，菌株号CGMCC 1.230。将此菌株搭载神州八号飞船飞行398 h后返回地面，分离出LCT-BC25和LCT-BC235两株空间诱变菌株。同时地面做相应温度对照株培养，命名为LCT-BC244。经细菌分型鉴定LCT-BC244的16S rRNA基因序列与蜡状芽孢杆菌14 579 100%相似。

2 蛋白质组检测 根据标准定量蛋白组学的实验方法[5]。首先从3组样品中提取细菌蛋白质，进行还原烷基化处理，打开二硫键以便后续充分酶解蛋白。用GE公司的2D quant kit法进行蛋白质浓度测定。等体积进行十二烷基磺酸钠(SDS)电泳后进行酶解蛋白。用iTRAQ试剂标记肽段，将标记后的肽段进行等量混合，使用强阳离子交换色谱(strong cation exchange choematography，SCX)进行预分离。最后进行液相串联质谱(liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析。

3 生物信息分析 对于质谱下机的原始文件进行峰识别，得到峰列表。建立参考数据库进行肽段及蛋白质鉴定。所有鉴定到的蛋白质进行COG功能分析、GO功能分析和KEGG通路分析。最后比较各蛋白在各样品之间的相对含量，从而获得一些感兴趣的重要蛋白。本研究中当蛋白质定量值同时满足以下条件视为最终的差异蛋白：1)进行3次重复实验，某个蛋白至少出现在2次重复实验中；2)蛋白丰度差异倍数＞1.2倍；3)经多重假设检验(multiple hypothesis testing)，其P＜ 0.05。

结 果

1 蛋白质组鉴定 3次重复实验共得到418 896张谱图，11 453个肽段。蛋白质数据库匹配后得到1 501个蛋白质。取3次重复实验中出现≥2的蛋白质作为最终鉴定到的可能蛋白质。最终得到1 269个可能蛋白质。

2 功能分析 对1 269个可能的蛋白质进行COG功能分析发现，80%以上的蛋白质分布于能量的生成和转换、氨基酸的转运和代谢、翻译过程和核糖体的结构和生物合成、转录过程、信号转导机制(图1)。GO功能分析发现，大部分蛋白的功能与代谢活性和细胞学过程相关(图2)。KEGG代谢通路分析发现，这些蛋白大都与细菌的代谢过程和次级代谢相关。

3 蛋白定量分析 两株经空间诱变的蜡状芽孢杆菌与地面对照株比较，差异表达蛋白的分布情况如图3所示。该图显示了三次重复中蛋白定量平均值分布情况，其中横坐标表示差异倍数经过以2为底数的对数转化后的值。＞0的为表达量上调，＜0的为表达量下调。其中LCTBC25与地面对照株LCT-BC244比较有57个蛋白上调，77个蛋白下调；LCT-BC235与地面对照株LCT-BC244比较有8个蛋白上调，73个蛋白下调。

图1 COG分类不同功能的蛋白质的统计数量Fig. 1 Proteins with different functions according to COG

图2 GO功能分析各条目数量占总蛋白数量的百分比Fig. 2 Number of proteins/total number of proteins (%) according to GO

图3 空间诱变蜡状芽孢杆菌LCT-BC25 (左)和LCT-BC235 (右)蛋白质丰度分布图Fig. 3 Protein abundance distribution in space environment-induced LCTBC25 strain (left) and LCT-BC235 strain (right)

表1 空间诱导蜡状芽孢杆菌LCT-BC25差异表达蛋白Tab. 1 Differentially expressed proteins of space environment-induced LCT-BC25 strain

表2 空间诱导蜡状芽孢杆菌LCT-BC235差异表达蛋白Tab. 2 Differentially expressed proteins of space environment-induced LCT-BC235 strain

4 差异表达蛋白 在上述分析的基础上，分别从LCT-BC25和LCT-BC235中筛选出最具差异的5个上调蛋白和5个下调蛋白(表1、表2)。LCTBC25和LCT-BC235差异蛋白的不同说明空间突变的不定向性。差异蛋白大都是一些代谢活性和调节相关蛋白。LCT-BC235的溶血性肠毒素高表达，提示其毒力和致病力可能增强。

讨 论

既往关于微重力对细菌致病性的影响研究最多的是肠道沙门氏菌。多个研究都表明经过空间环境诱导后沙门菌的毒力增强[6-7]。此外，Chopra等[8]使用双向凝胶电泳检测方法来探讨微重力致细菌毒力改变的机制，研究在模拟微重力条件下对大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌蛋白质表达的影响。其研究发现，模拟微重力暴露后的致病性大肠杆菌，74种蛋白表达升高，18种蛋白表达不足，新表达的蛋白有62种。而对于鼠伤寒沙门氏菌则分别为35种、33种和57种。通过Northern Blot方法发现暴露于模拟微重力条件下的产毒性大肠杆菌编码毒力因子LT-1的基因发生上调。但目前空间微生物学相关研究的研究尚处于起步阶段，关于微重力致细菌毒力改变的机制仍不明确。对于同为肠内常驻菌群的蜡状芽孢杆菌未有研究报道。对病原微生物进行蛋白组学研究有利于从分子层面揭示相关的致病机制，阐明疾病的发病机理[9]。尤其是空间极端环境能够导致细菌的致病力和毒性发生改变，对空间飞行后的菌株进行相关研究具有重要的现实意义[10-11]。

蜡样芽胞杆菌与少数食物中毒有关(约2%~5%)，这是由于蜡状芽孢杆菌产生肠毒素，人食用含毒素的食物产生一系列包括严重的恶心、呕吐以及腹痛腹泻等不良反应。我们的研究发现，经过搭载神舟八号飞船空间诱变后的蜡状芽孢杆菌大部分鉴定到的蛋白质属于代谢相关蛋白，可见在空间环境的诱导下细菌通过自身代谢水平的调节发生对空间极端环境的适应性过程。经过空间诱变后，两株蜡状芽孢杆菌均出现了明显差异表达的蛋白质，但是这两株细菌差异表达的蛋白质谱明显不同，说明了空间突变的不定向性。空间诱变蜡状芽孢杆菌LCT-BC25主要的差异蛋白与代谢调节水平相关；而LCT-BC235除了有代谢相关蛋白改变，还出现了溶血性肠毒素蛋白的明显高表达，提示这株细菌可能有较强的毒力，极有可能对空间站航天员造成潜在的危害。但目前对于该溶血性肠毒素基因的相关研究较少，有待于进一步研究该基因改变的意义和相关的致病机制。

本研究是一个对空间环境下蜡状芽孢杆菌的蛋白质组进行测序和分析的实验研究，这为揭示蜡状芽孢杆菌在空间的变化和毒力改变奠定了基础，为后期我国空间站的建立和宇航员的健康提供了保障。

1 Per EG， Terje L. Bacillus cereus and its food poisoning toxins［J］.FEMS Microbiol Lett， 1997， 157（2）： 223-228.

2 Jensen GB， Hansen BM， Eilenberg J， et al. The hidden lifestyles of Bacillus cereus and relatives［J］. Environ Microbiol， 2003， 5（8）：631-640.

3 Kotiranta A， Lounatmaa K， Haapasalo M. Epidemiology and pathogenesis of Bacillus cereus infections［J］. Microbes Infect，2000， 2（2）：189-198.

4 Novikova ND. Review of the knowledge of microbial contamination of the Russian manned spacecraft［J］. Microb Ecol， 2004， 47（2）：127-132.

5 Unwin RD， Griffiths JR， Whetton AD. Simultaneous analysis of relative protein expression levels across multiple samples using iTRAQ isobaric tags with 2D nano LC-MS/MS［J］. Nat Protoc，2010， 5（9）： 1574-1582.

6 Wilson JW， Ott CM， Höner zu Bentrup K， et al. Space flight alters bacterial gene expression and virulence and reveals a role for global regulator Hfq［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2007， 104（41）：16299-16304.

7 Nickerson CA， Ott CM， Mister SJ， et al. Microgravity as a novel environmental signal affecting Salmonella enterica serovar Typhimurium virulence［J］. Infect Immun， 2000， 68（6）： 3147-3152.

8 Chopra V， Fadl AA， Sha J， et al. Alterations in the virulence potential of enteric pathogens and bacterial-host cell interactions under simulated microgravity conditions［J］. J Toxicol Environ Health A， 2006， 69（14）： 1345-1370.

9 杨彩娥，匡铁吉．比较蛋白质组学及其在结核分枝杆菌研究中的应用［J］.军医进修学院学报，2007，28（5）：389-392．

10 刘长庭．空间环境对微生物的影响及意义［J］.军医进修学院学报，2012，33（5）：433-434．

11 刘长庭．利用空间环境服务于人类健康［J/OL］. http：//www.cnki.net/KCMS/detail/11.3275.R.20120906.1723.004.html