重组人干扰素α1b空间诱变菌种初步筛选研究

王俊锋，刘金毅，方向群，徐 晨，郭英华，刘桂东，常 德，陆小冬，刘长庭

1解放军总医院 南楼呼吸科，北京 100853；2北京三元基因工程有限公司，北京 102600

空间环境存在着微重力、强辐射、高能粒子、交变磁场等多种独特的作用，可以使生物发生一些基因变异。利用空间环境对质粒上带有目标表型结构基因的基因工程菌进行太空诱变，可获得产量高或者具有新性状的突变菌株，从而提高生物制剂的产量[1-3]。本研究利用“神舟八号”飞船对表达重组人干扰素α1b的基因工程菌株进行空间诱变，返回地面后筛选高表达目的产物的生物工程菌菌株。

材料和方法

1 菌株 重组人干扰素α1b菌种由北京三元基因工程有限公司提供。

2 培养基 LB(luria bertani)培养基：0.5%(w/v)酵母提取物(yeast extract)，1%(w/v)胰蛋白胨(tryptone)，1%(w/v)氯化钠(NaCl)，双蒸水补足体积。若配制固体培养基，则再加入1.5%~2%的琼脂，充分搅拌溶解，121℃灭菌20 min。氨卞青霉素培养基(LB-Amp)：待LB培养基冷却到50~60℃，加入100 mg/ml Amp 0.1%混匀。

3 菌种实验卫星搭载 重组人干扰素α1b菌种搭载“神舟八号”飞船。该飞船于2011年11月1日发射，11月17日返回地面，在轨运行398 h，全程运行1 100万公里。

4 菌种筛选 首先进行平板分离：取250μl IFNα1b-2L1A菌液接种于装有750μl 0.9%氯化钠注射液的试管中，混匀；再取100μl稀释后的菌液接种于装有900μl 0.9%氯化钠注射液的试管中，依次稀释至第5管，取100μl涂布于LB平板，37℃静止培养12~20 h。抗性平板初筛：用灭菌枪头挑取平板上不同大小的菌落单克隆，接入含有LB-Amp的平板，每板接种50个单克隆，共接种6板(共计300个单克隆)。同时在无抗性培养基上对照接种，37℃静止培养5~7 h。试管复筛：用接种针挑取抗性平板上的单菌落，接入含有5 ml相同抗性的LB液体培养基中，37℃、180 r/min震荡12~16 h。

5 诱导表达 首先测定每管菌液的OD600，按照OD600=1.5接种500μl菌液的比例，将相同数量的菌量接种装有5 ml LB-Amp培养基的种子试管，37℃、180 r/min震荡培养至OD600在0.6~0.8之间，记录各个试管中的OD600。然后加入诱导剂IPTG，使其终浓度为1 mmol/L，37℃、180 r/min震荡诱导表达4 h。

6 目的蛋白第一轮SDS-PAGE分析 诱导结束后，取1 ml菌液离心，留取沉淀。向沉淀中加入75μl 10% SDS和75μl 8 mol/L尿素，混悬均匀后，超声清洗仪内超声20 min，加入50μl 4倍还原性样品缓冲液，混匀后沸水浴10 min，离心，取5μl上清进行第一轮SDS-PAGE检测。电泳结束后进行考马斯亮蓝染色，脱色后用Line软件分析目标蛋白的灰度及纯度。分别选择每块胶上目的条带灰度或纯度最大的克隆，总数不超过30个克隆。

7 目的蛋白第二轮SDS-PAGE分析 对上个步骤所选择的单克隆集中在两块凝胶上进行SDS-PAGE检测，上样量为4μl。电泳结束后进行考马斯亮蓝染色，脱色后用Line软件分析目标蛋白的灰度及纯度。分别选择每块凝胶上目的条带灰度或纯度最大及次大的克隆，总数不超过8个。

结 果

1 抗性平板初筛 在抗性和非抗性平板均生长的阳性克隆为221株，占73.7%；仅在LB平板生长的阴性克隆数(抗性丢失)79株，占26.3%。

2 第一轮电泳分析筛选 对抗性平板初筛结果阳性克隆中编号在前的144株(克隆号1-194)进行试管复筛和诱导表达后，进行电泳检测和软件分析。根据IFNα1b理论分子量19.4kU以及以往经验，按照M1或M2的分子量进行计算，以软件分析IFNα1b条带的灰度及纯度，其中以灰度代表目的蛋白的总量，总灰度代表菌体总蛋白的量，纯度代表目的蛋白占菌体总蛋白的比例。选取每次电泳15个克隆中灰度或纯度最高的克隆用于下一轮检测，灰度及纯度最大值与次大值所对应的克隆号中：37、64、93是重复出现，合并后为26个克隆，即5、18、19、25、37、41、49、60、61、62、64、77、87、93、105、112、113、127、139、147、149、159、175、178、191、194。

3 第二轮电泳分析筛选 对选出的26个克隆电泳样品集中进行SDS-PAGE并分析(见图1)。选出4个克隆中灰度或纯度最高的克隆，灰度及纯度最大值与次大值所对应的克隆号中：60、127是重复出现，合并后为6个克隆，即49、60、87、93、127、191。这6个克隆的两轮检测结果见表1。

图1 26个克隆的第二轮电泳图M1为蛋白质分子量标准，自上至下分别为：94.0、66.2、45.0、33.0、26.0、20.0和14.4 kU；M2为预染蛋白质MarkⅢ，自上至下分别为：94、60、45、27、18 kU；C为重组人干扰素α1b对照品；图下方最明显的条带为目的蛋白Fig. 1 Second SDS-PAGE gel images of 26 colonies M1 represents the standard protein MW from top to bottom,94.0, 66.2, 45.0, 33.0, 26.0, 20.0, and 14.4 kU. M2 is the Mark III of pre-stained proteins from top to bottom, 94, 60, 45, 27, and 18 kU. C represents the control of recombinant human INFα1b.The most obvious strip at the bottom is the target protein

表1 最后筛选到的六个克隆的两轮检测结果Tab. 1 Six colonies obtained after 2 time of screening

讨 论

太空生物制药是通过航天搭载来实现的[4-6]，具体来说，就是利用返回式空间飞行器，将生物制药菌种或细胞送入太空，在地面难以模拟的太空环境下，促进菌种或细胞的生长和变异，取得地面上无法获得的诱变效果，如利用空间环境使相对呈漂浮伸展状态的生物染色体受到外界因素的冲击，引起碱基的缺失、置换或插入(如引起生物DNA大分子断裂，使双螺旋中的氢键断裂，或断裂后再交叉联接，或促使碱基降解)，从而改变基因内部原有的碱基及排列顺序，引起表型发生改变，产生新的遗传变异，并且在返回地面后进行培育、筛选得到生产性能优良的微生物菌种或细胞，形成规模化生产。而微生物和动植物细胞是目前药品的主要来源，但有些药物的地面生产能力非常有限，于是利用微生物和动植物细胞的航天搭载技术来生产出更多、性状更好的药物，成为航天技术应用于制药行业的重要课题。

重组人干扰素是一种常用的药物，在临床上应用十分广泛，它与细胞表面受体结合，诱导细胞产生多种抗病毒蛋白，从而抑制病毒在细胞内的复制，具有广谱抗病毒、抗肿瘤、抑制细胞增殖以及提高免疫功能等作用[7-10]。目前市场上的重组人干扰素价格较贵，如果提高生物工程菌的产能，其价格也会相应便宜。本研究选择重组人干扰素α1b进行“神舟八号”搭载，返回地面后经过初步筛选获得6株表达较高的空间诱变菌株，证实空间环境对生物工程菌的确存在诱变作用。通过空间多重因素交互作用下，产生了目的蛋白表达量不同的基因工程菌菌株。但空间诱变的具体机理还不是很清楚，空间环境中存在着微重力、强辐射、高能粒子、交变磁场等多种独特因素，这些因素是如何作用？此次诱变过程是哪种因素占据了主导作用？均不是很清楚。另外，目前初步筛选出6株表达较高的空间诱变菌株，其表达量是否高于出发菌株？遗传稳定性怎么样？目的蛋白的生物学活性是否发生改变？均尚需进一步研究。

1 魏丽勤，方晓梅，李宁梅，等．太空搭载泰乐［1］魏丽勤，方晓梅，李宁梅，等．太空搭载泰乐菌素高产菌株的选育［J］.工业微生物，2007，37（1）：1-7．

2 蒋培霞，张瑞萍，王海胜，等．紫色杆菌素合成工程菌太空诱变效应及其高产菌株的筛选［J］.化工学报，2010，61（2）：455-461．

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4 王艳芳，赵彦宏，刘林德，等．空间诱变微生物研究进展［J］.安徽农业科学，2009，37（16）：7335-7336，7342．

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7 李刚．重组人干扰素α1b对小儿轮状病毒腹泻患者外周血T淋巴细胞亚群的影响研究［J］.现代预防医学，2012，39（6）：1389-1390．

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10 Masci P， Olencki T， Wood L， et al. Gene modulatory effects，pharmacokinetics， and clinical tolerance of interferon-alpha1b ： a second member of the interferon-alpha family［J］. Clin Pharmacol Ther， 2007， 81（3）： 354-361.