缺氧诱导因子2α基因敲除对小鼠动脉粥样硬化发生的影响

陈 倩，张 明，王海军，丁 宇

1解放军总医院 南楼心血管一科，北京 100853；2上海交通大学医学院附属仁济医院 肝外科，上海 200127

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是多种心脑血管事件形成的病理学基础，其发生的原因和机制一直是医学领域内的重要研究课题。近年来研究发现缺氧在AS的发生发展过程中扮演了十分重要的角色[1-4]。缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)是机体缺氧应答机制的核心效应分子，其中HIF-2α与血管内皮细胞功能、炎性反应以及脂质代谢的关系最为密切[5]。本实验拟通过建立HIF-2α基因敲除小鼠模型，通过高脂饲料喂养，了解HIF-2α基因对动脉粥样硬化病变形成的影响。

资料和方法

1 实验动物 HIF-2α-LoxP标记小鼠(JAXMICE：008407)和Mx-Cre转基因小鼠(JAXMICE：003556)从美国Jackson实验室引进。ApoE基因缺陷(ApoE-/-)小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。所有研究均采用雄鼠，8~12周龄，体质量20~28 g。

2 建立HIF-2α基因敲除小鼠模型 HIF-2α-LoxP标记小鼠和Mx-Cre转基因小鼠交配后，经过两次传代和基因型鉴定筛选，获得Mx-Cre阳性且HIF-2α纯合LoxP标记小鼠。对这种小鼠进行连续3次腹腔注射聚肌胞，每4 d 1次，通过诱导干扰素产生后即可获得全身HIF-2α基因敲除(HIF-2α-/-)小鼠[6]。小鼠基因型鉴定采用鼠尾标本的普通PCR鉴定,确认目的基因敲除则采用HIF-α激活剂DMOG 8mg腹腔注射3h后肝组织标本的HIF-2α免疫印迹分析。Mx-Cre阴性HIF-2α纯合LoxP标记小鼠为野生型对照小鼠。

3 分组及方法 同龄HIF-2α-/-小鼠、野生型小鼠及ApoE-/-小鼠每组6只，进行高脂高胆固醇饲料喂养8周。高脂饲料(0.15%胆固醇、 25%猪油、5%糖、85%基础饲料)购自中国医学科学院实验动物研究所。所有实验动物8周后取主动脉10%甲醛固定，石蜡包埋，进行常规HE染色，观察主动脉粥样硬化病变情况。

结 果

1 HIF-2α基因敲除鼠的鉴定 经过杂交、筛选及聚肌胞注射诱导后成功建立HIF-2α基因敲除小鼠模型，见图1。

2 主动脉内膜病变 经高脂饲料喂养8周后，主动脉的HE染色结果显示，ApoE-/-小鼠可见AS病变，野生型小鼠主动脉可见轻度内膜增生，HIF-2α-/-小鼠未见明显内膜增生(见图2、3、4)，提示HIF-2α基因敲除对小鼠AS病变的形成有抑制作用。

讨 论

缺氧诱导因子(HIF)是机体缺氧应答机制的核心效应分子，由α亚基和β亚基组成具有转录活性的异源二聚体。其中α亚基严格受到氧气浓度调控，是HIF的调节亚基，而β亚基则持续性表达。因此，对HIF的研究主要集中在HIF-α。哺乳动物共存在三种HIF-α亚基(HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α)，HIF-1α最早被发现，目前研究较为成熟的是在肿瘤领域。AS与肿瘤在某些方面有相似的病理生理过程，缺氧时HIF-1α和HIF-2α促进血管内皮生长因子(VEGF)等多种血管生成因子表达，促进生理性及病理性微血管生成，管壁内形成的大量微血管使得管壁进一步狭窄。由于形成的微血管为非功能性血管，管腔缺血缺氧进一步加重，形成恶性循环，使得AS进一步发展[7-8]。HIF-2α是血管组织有效适应缺氧环境的关键性反应因子，对于缺血缺氧及再灌注条件下保护血管内皮细胞免于细胞凋亡、保持正常功能有着至关重要的作用。HIF-2α的靶基因涉及到血管生长、收缩和舒张，骨髓造血、能量代谢、儿茶酚胺合成和铁代谢等方面，与HIF-1α相比，HIF-2α明显在炎性细胞表达、巨噬细胞迁移方面更为重要，在维持机体脂肪酸代谢平衡中HIF-2α起到主要调控作用[5,9]。

由于HIF-2α基因对胚胎发育至关重要，采用常规全基因敲除方法会导致小鼠在胚胎期死亡，无法得到HIF-2α基因敲除的成年小鼠实施研究，因此针对HIF-2α实施基因敲除必须采用Cre/LoxP方法。Cre重组酶是整合酶家族的一员，LoxP则是一段长34bp的回文DNA片段。Cre/LoxP系统一个最重要的特点是在Cre重组酶作用下两个LoxP位点间能发生重组，当两个LoxP反向时，使LoxP间的外源基因反向连接。当同向时，Cre重组酶剪切LoxP间的外源片段，并保留后边一个LoxP位点，从而实现目的基因的条件性敲除[10]。

ApoE-/-小鼠于1992年问世，无论正常或高脂饮食均可形成严重的高脂血症并自发形成纤维斑块和复合斑块，斑块分布与人类AS斑块的分布极为相似，是研究AS的经典常用模型，在本研究中作为阳性对照小鼠。结果显示，经过相同条件下的高脂喂养8周，ApoE-/-小鼠主动脉呈现典型的AS样改变，野生型小鼠主动脉内膜呈不同程度的增生，而HIF-2α-/-小鼠的主动脉未见内膜增生，提示HIF-2α基因敲除可抑制小鼠AS病变的形成，针对HIF-2α基因的治疗可能成为AS治疗策略中的一个重要手段，其作用机制还有待进一步研究。

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