疫苗免疫对小鼠神经系统发育影响的初步探讨

王 政，韩玉霞，赵 琪，张东霞

1解放军总医院 小儿外科，北京 100853；2山东省滨州职业学院护理学院，山东滨州 256603；3山东省烟台市毓璜顶医院，山东烟台 264000

本研究着眼于疫苗免疫对神经系统发育的影响，运用同源氨基酸比对及SYFPEITH抗原预测计算机软件，将制备计划免疫所有疫苗病原体的全氨基酸序列(其中表达病原微生物抗原的基因序列作为筛选重点)，与购买的神经系统发育障碍血清样本的分子氨基酸序列进行比对，寻找同源性(≥5-6AA)及免疫原性较高的氨基酸序列作为研究靶点，进行人工合成。免疫成年Balb/c小鼠和乳鼠后，进行脑神经系统病变、免疫系统反应以及行为测试，筛选出对神经系统影响较大的序列，进而找到神经系统发育相关基因。

材料和方法

1 氨基酸序列的比对及化学合成 运用同源氨基酸比对及SYFPEITH抗原预测计算机软件，将所有计划免疫疫苗的全基因序列与神经系统发育障碍相关蛋白Caspr2、Fmr1氨基酸序列进行同源性比对，寻找同源性≥5-6AA的肽段序列，并分别命名为AS-1到AS-10，所有序列送往上海生物工程研究所进行合成。

2 神经系统发育障碍血清 从美国Archie and Mary-louise Sliver神经发育中心订购神经系统发育障碍血清，-70℃保存待用。

3 小鼠免疫 C57BL/6乳鼠购买于Jackson实验室，并于北京市微生物流行病研究所长期饲养，清洁级，体质量10~15 g。1~3周C57BL/6乳鼠25只，随机分成5组于动物中心常规饲养，AS-2、AS-4、AS-8、AS-9、AS-10与铝佐剂进行1∶1混合，20μg/只，进行腹腔注射2次，间隔1周。分离小鼠血清用于抗体监测，同时使用心血管灌注法行全身灌注，分离小鼠大脑组织，-70℃冰冻切片，大脑切片组织用于免疫组织化学检验。

4 ELISA检验 AS-1到AS-10共10个肽段，使用ELISA稀释液进行稀释后包被ELISA板。将购买的神经系统发育障碍血清行1∶100稀释，使用间接ELISA的方法检测血清中抗AS抗体效价。

5 免疫组织化学检查 收获的大脑组织于-70℃进行冰冻切片，7μm的切片置于放置PBS的24孔板中。常规免疫组织化学方法进行anti-CD3检测，方法参考《现代免疫学实验技术》。

6 统计学分析 所有统计数据和图片生成使用Prism5.0(GraphPad.Prism 5.0)，采用t-test方法对血清OD值进行统计分析。

结 果

1 氨基酸序列的比对及化学合成 运用AIM氨基酸比对及SYFPEITH抗原预测计算机软件，将所有计划免疫疫苗的全基因序列神经系统发育障碍相关蛋白Caspr2、Fmr1氨基酸序列进行同源性比对，寻找同源性≥5-6AA的氨基酸序列，并分别命名为AS-1到AS-10，结果见表1。将所有短肽送往专业公司进行合成。

2 神经系统发育障碍血清抗AS抗体 将神经系统发育障碍血清分别用合成好的10条短肽进行包板，运用ELISA方法检测正常小鼠及神经系统发育障碍血清中抗上述10条短肽的抗体，发现神经系统发育障碍血清中抗AS-2、AS-4、AS-8、AS-9、AS-10抗体具有增高趋势，其中抗AS-4抗体效价明显高于对照组(P＜0.001)，见图1。

3 小鼠脑组织T细胞侵润 已经建立了乳鼠动物模型，将合成抗原肽中AS-2、AS-4、AS-8、AS-9、AS-10与铝佐剂混合后，分别进行乳鼠腹腔免疫，同时设立佐剂单独注射组作为对照。在第2次注射后3~7 d内收获小鼠，进行心血管灌注后分离脑组织进行冰冻切片。使用免疫组化方法检测，发现AS-4免疫组出现了大脑T细胞侵润，见图2。

表1 疫苗与Caspr2、Fmr1同源序列比对结果Tab.1 Comparison of homologous sequences of vaccine,Caspr2 and Fmr1

图1 神经发育障碍和正常血清中抗AS抗体滴度比较Fig.1 Development disturbance of nervous system and normal serum anti-AS antibody titer

图2 AS-4免疫后脑组织中T细胞侵润Fig.2 Infiltration of T lymphocytes in mouse brain of AS-4 immunized mice

讨 论

大脑免疫系统异常与神经系统发育障碍相关联的观点已经被认同[1-5]。例如，大部分神经系统发育障碍儿童都有自身免疫疾病和过敏性疾病的家族史及自身免疫性疾病和过敏性疾病的症状，有抗多种脑蛋白的抗体滴度升高，大脑中都发现有炎症改变[4,6-7]。约翰霍浦金斯大学的卡洛斯-帕德威廉兹教授对11位去世的孤独症患者脑组织和6位活着的孤独症儿童脑脊液进行研究，结果也表明大脑免疫活性与神经系统发育障碍之间有着密切联系，认为神经系统发育障碍性疾病患者出现反常活动是由中枢免疫系统产生细胞因子所致[8-10]。

我们的研究结果表明，神经系统发育障碍血清中存在高效价的抗疫苗抗体，该抗体与机体基因为同源序列，是一种自身抗体。用AS-4肽段免疫乳鼠后可以发现脑组织中出现T细胞侵润。这种与神经系统发育障碍发病基因具有同源序列的肽段能够导致小鼠神经系统损伤。

我们认为：在反复疫苗刺激过程中，机体可能产生“错认”现象，即所谓自身免疫现象。由于疫苗诱导，机体免疫系统很可能对与疫苗相同序列的蛋白物质产生免疫反应。当然，这还需要进一步大量研究数据支持。

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