α-硫辛酸对糖尿病大鼠内质网应激相关分子GRP78和Caspase-12表达的影响

王国贤，李瑞芳，商淑慧，李 飞，李兆刚，刘珊珊

1辽宁医学院 药理教研室，辽宁锦州 121001；2河北省邯郸市中医院，河北邯郸 056000

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病引发的一种慢性病症，它以心肌病理改变为特征。DCM的发病机制非常复杂，涉及到心肌肥大，细胞凋亡增加，自主神经功能紊乱等多种机制，其中，心肌功能改变、凋亡增多是DCM重要的病理改变之一，但其机制尚未明了。符丽娟[1]等学者发现，在糖尿病心肌病的发生发展过程中，确实存在心肌细胞凋亡的现象。内质网应激是一种新的细胞凋亡途径，它不同于死亡受体途径和线粒体途径[2]。适量的内质网应激可保护细胞，持续或长时间的内质网应激则会加速细胞凋亡。当发生内质网应激时，它的经典标志物GRP78蛋白大量表达，并激活3条凋亡通路，相应凋亡机制包括：CHOP(C/EBP homologous protein)转录激活；JNK(c-Jun N-terminal Kinases)信号途径活化；Caspase-12的活化等。而Caspase-12通路是内质网特有依赖性的细胞凋亡信号转导通路。

α-硫辛酸是公认的万能抗氧化剂，对糖尿病大鼠的心肌细胞有一定的保护作用[3]。本实验通过建立糖尿病心肌病大鼠模型，从内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)的角度研究α-硫辛酸对糖尿病心肌病大鼠ERS经典标志物GRP78及特有的凋亡途径Caspase-12表达的影响，以探讨α-硫辛酸是否能通过阻断ERS引发的Caspase-12特有细胞凋亡途径对心肌细胞产生的保护作用。

材料和方法

1 材料 α-硫辛酸(美国Sigma公司)，链脲佐菌素 (Streptozocin，STZ)(美 国 Sigma公 司 )。SureStep Plus血糖检测仪(美国强生公司)。TUNEL染色试剂盒(南京凯基生物公司)。GRP78一抗、二抗(北京博奥森试剂公司)，Caspase-12单克隆抗体(abcam生物制品有限公司)，血流动力学测定仪器(浙江大学仪器厂制造，H231025)。

2 糖尿病模型建立与分组 健康雄性SD大鼠50只，体质量200~250 g(由辽宁医学院实验动物中心提供)，饲养1周后，其中随机选取35只，采用链脲佐菌素以60 mg/kg于左下腹腔一次性注射建立大鼠糖尿病模型。另15只注射枸橼酸缓冲液当做正常对照组。72 h后尾静脉取血，测血糖，以血糖≥16.7 mmol/L为造模成功。造模中：3只死亡，2只造模失败。30只糖尿病大鼠随机分为2组，糖尿病组和α-硫辛酸组，每组各15只。造模成功后饲养1周，α-硫辛酸治疗组每日9：00给予灌胃60 mg/(kg·d)连续12周，糖尿病组及正常组给予等量0.9%氯化钠注射液灌胃。

3 血糖和血流动力学测定 各组大鼠于实验结束前采用SureStep Plus血糖仪检测空腹血糖。然后给予腹腔麻醉，分离颈总动脉，并将微型心导管经颈总动脉送至左心室，测定左室收缩末压(LVSP)和舒张末压(LVEDP)、左室压力最大上升和下降速率 (±dp/dt max)。

4 TUNEL测定细胞凋亡 切片常规脱蜡水化后，加入蛋白酶K工作液，37℃反应30 min，PBS浸泡5 min，清洗3次。切片滴加2滴封闭液，室温(15~25℃)封闭10 min后再用PBS清洗。样本滴加100μl TdT酶反应液，避光湿润37℃反应1 h后PBS清洗。滴加100μl Streptavadin-HRP，避光湿润37℃反应30 min，PBS清洗。每张片子加2滴现配制的DAB溶液。镜下观察染色深浅，染好后用蒸馏水终止显色反应。将切片放入苏木素染液，染色10 min，用蒸馏水冲洗干净。最后进行封片，并在显微镜下观察。随机选取5个高倍视野，计算出平均每100个细胞中的凋亡细胞数，以百分数(%)表示凋亡指数(apoptotic index，AI)。

5 GRP78和Caspase-12蛋白测定 采用Western Blot法，取-80℃冻存心肌标本100 mg加入裂解液中剪碎后移入1.5 ml EP管中，4℃12 000 r/min离心25 min，取上清液进行蛋白定量。SDS-PAGE电泳，浓缩胶电压80 V，分离胶电压120 V，半干法将蛋白质转移到PVDF膜上，恒压电泳95 V，室温1 h，4℃卵育过夜，按0.1 ml/cm2膜面积加入1∶500一抗，杂交2h，封闭液漂洗后按0.1 ml/cm2膜面积加入1∶500二抗，摇床杂交2 h，漂洗后加显色剂，避光显色2~5 min，条带出现，终止反应。以β-actin作为内参，进行比较。

6 免疫组织化学法检测Caspase-12蛋白表达 石蜡防脱切片后60℃烤片90 min；常规脱蜡至水洗；高压热修复抗原；滴加正常羊血清封闭液；滴加1∶100稀释一抗；滴加生物素化二抗；滴加试剂SABC；DAB显色；苏木素轻度复染；脱水，透明，封片。

7 统计学分析 所统计学方法数据用-x±s表示，采用SPSS17.0统计软件，进行单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 α-硫辛酸对大鼠血糖、心功能影响 与正常组比较，α-硫辛酸组血糖升高，心功能出现异常；糖尿病模型组大鼠血糖升高、心功能LVSP降低、LVEDP升高、+dp/dtmax和-dp/dtmax降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。与糖尿病模型组比较，α-硫辛酸组血糖降低但仍高于正常组，LVSP升高、LVEDP降低、+dp/dtmax、-dp/dtmax体现出不同程度升高、差异具有统计学意义(P＜0.05)，说明α-硫辛酸能改善糖尿病大鼠的血糖和心功能。见表1。

2 GRP78和Caspase-12蛋白含量测定 与对照组比较，糖尿病模型组大鼠中GRP78和Caspase-12蛋白表达值明显增高(P＜0.05)，α-硫辛酸干预组中GRP78和Caspase-12表达值低于糖尿病模型组(P＜0.05)。见图1、表2。

3 TUNEL测定细胞凋亡 正常组心肌内偶可见细胞凋亡，糖尿病组凋亡细胞数明显增多，α-硫辛酸组AI(7.19±0.29)%明显少于糖尿病组AI(11.28±0.33)%(P＜0.05)，但高于正常组 AI(1.05±0.25)%(P＜0.05)。凋亡细胞为棕色，正常细胞为蓝紫色(×400)。见图2。

4 免疫组织化学检测 正常组大鼠心肌中GRP78和Caspase-12的蛋白表达较弱，表现出轻度或点状染棕黄色；糖尿病组大鼠心肌GRP78和Caspase-12蛋白表达呈强阳性，着色范围大，呈棕褐色；α-硫辛酸组GRP78和Caspase-12蛋白表达呈阳性，中等范围着棕色。与正常组比较，糖尿病组灰度值均显著降低(P＜0.05)；与糖尿病组比较，α-硫辛酸组灰度值有所提升，但仍低于对照组，(灰度值越低，蛋白表达量越高)。见图3、表3。

表1 各组大鼠血糖、心功能比较Tab.1 Blood glucose level and cardiac function in different groups(-x±s, n=15)

表2 各组大鼠心肌组织GRP78和Caspase-12与β-actin比值Tab.2 Ratio of GRP78 and caspase-12 vs β-actin on myocardial tissue of different groups

表3 各组大鼠心肌组织GRP78和Caspase-12蛋白质表达水平比较Tab.3 Expression level of GRP78 and caspase-12 in myocardial tissue of different groups

图1 Western blot检测大鼠GRP78和Caspase-12蛋白水平A：正常组；B：糖尿病模型组；C：α-硫辛酸组Fig.1 Western blot showing expression level of GRP78 and caspase-12 in rats A: Control group; B: Diabetic group; C: A - LA group

讨 论

近来研究发现内质网应激诱导的细胞凋亡，是一种不同于死亡受体途径和线粒体途径的新的凋亡途径[4-5]。ERS通过两种途径对细胞产生影响。其一，保护细胞，维持内环境稳态，促使细胞生存。其二，诱导细胞凋亡，在强刺激或持续过久的ERS时，GRP78大量表达并激活多条途径诱导细胞凋亡，Caspase-12凋亡途径为其经典途径。

GRP78是内质网分子伴侣，是检测ERS的标志蛋白[6]，在正常状态下，GRP78没有或者表达极少。但当ERS状态下，GRP78大量表达。GRP78对内质网内环境极度敏感，很多能引起内质网应激变化的因素都能直接或间接引起GRP78表达的改变，如高血糖、高血压、氧化应激、炎症等因素都可引发其蛋白大量释放。本实验结果显示，糖尿病模型组GRP78大量表达，α-硫辛酸实验组GRP78表达高于正常组，但明显低于糖尿病组，提示用α-硫辛酸治疗减弱了糖尿病大鼠心肌组织局部ERS状态。

正常状态下Caspase-12无活性并滞留于内质网表面。当ERS持续加强后，Caspase-12解离，游离的Caspase-12直接激活Caspase-9，后者通过活化Caspase-3等一系列反应，最终导致细胞凋亡。因此游离的Caspase-12是可导致细胞凋亡的关键蛋白[7]。Caspase-12定位于内质网表面，是介导ERS凋亡的关键蛋白酶，在膜受体或线粒体凋亡途径中不被活化，且已被证实[8-9]。本实验结果显示，Caspase-12在糖尿病组表达最高，细胞凋亡增多；α-硫辛酸组蛋白显著减少(P＜0.05)，同时细胞凋亡率明显降低(P＜0.05)，提示α-硫辛酸治疗组通过降低Caspase-12蛋白的含量，抑制细胞凋亡途径进而降低了糖尿病大鼠心肌细胞凋亡率。

本实验结果显示，正常组大鼠血糖，心功能都未出现异常，心肌组织中GRP78和Caspase-12仅有极少量表达，而糖尿病组大鼠血糖升高，心功能受损(LVSP降低、LVEDP升高、+dp/dtmax、-dp/dtmax降低)，心肌细胞凋亡数增多并伴有GRP78、Caspase-12蛋白大量表达，α-硫辛酸对糖尿病心肌病有一定的保护作用，降低血糖，改善心功能，并在一定程度通过抑制内质网应激反应的发生，减少Caspase-12和GRP78表达，进一步抑制了糖尿病心肌细胞凋亡的发生。

图2 TUNEL检测心肌细胞凋亡指数 A：正常组；B：糖尿病模型组；C：α-硫辛酸组Fig.2 TUNEL showing cell apoptotic index A: Control group; B: Diabetic model group; C: A - LA group

图3 免疫组织化学检测心肌Caspase-12蛋白水平 A：正常组；B：糖尿病模型组；C：α-硫辛酸组Fig.3 Immunohistochemistry showing caspase-12 protein expression level in myocardial tissue(×400)A: Control group; B: Diabetic model group; C: A-LA group

1 符丽娟，庞东渤，王洪新. 糖尿病大鼠心力衰竭时心肌细胞凋亡的研究［J］. 中西医结合心脑血管病杂志，2005，3（3）：236-237.

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6 Bertolotti A，Zhang Y，Hendershot LM，et al. Dynamic interaction of BiP and ER stress transducers in the unfolded-protein response［J］ .Nat Cell Biol，2000，2（6）：326-332.

7 李春君，于德民，张秋梅，等. 半胱氨酸蛋白酶-3及-9表达上调介导糖尿病大鼠心肌细胞凋亡及抗氧化剂α-硫辛酸的保护作用［J］. 中国医药，2009，4（5）：334-336.

8 Min N，Amy SL. ER chaperones in mammalian development and human diseases［J］. FEBS Lett，2007，581（19）：3641-3651.

9 Ohse T，Inagi R，Tanaka T，et al. Albumin induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in renal proximal tubular cells［J］.Kidney Int，2006，70（8）：1447-1455.