食管鳞癌组织中Bmi-1的表达及临床意义

孙永刚，谭绪云，杨小毛，杜选峰，王 辉，马占元，袁 利，曾青华，徐 倩，赵 倩，郑 倩

解放军第535医院 消化内科，湖南怀化 418000

食管癌是我国高发恶性肿瘤之一，死亡率非常高[1-2]。原癌基因Bmi-1属于polycomb家族，直接参与细胞生长增殖的调节。研究表明，Bmi-1基因的表达水平与肿瘤的发生、发展密切相关[3-6]。本研究采用免疫组织化学方法和荧光定量PCR检测Bmi-1在48例食管鳞癌组织及癌旁组织中的表达，探讨Bmi-1与食管鳞癌生物学行为的关系。

材料和方法

1 材料 本研究病理资料取自我院2008-2010年间住院手术的食管鳞癌患者，每例手术标本分别在食管鳞癌组织及对应癌旁5 cm组织取材，全部病例术前均未做化疗、放疗；其中男30例，女18例，年龄40~70(平均65.3)岁。所有病例均经病理确诊。SP试剂盒由福州迈新公司提供，兔抗人Bmi-1单克隆抗体由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。

2 免疫组织化学染色 标本经4%中性甲醛固定，石蜡包埋，切片厚3~4μm，免疫组化染色。免疫组化采用EnVision二步法，微波炉抗原修复，Bmi-1工作稀释度为1∶200，以公司提供的阳性片染色作为阳性对照，0.01 mol/L PBS(pH 7.4)代替一抗作为阴性对照，DAB显色，苏木素衬染后，脱水，透明，封片，光镜下观察。结果判断：Bmi-1免疫组化染色阳性信号在细胞核或细胞质呈现棕黄色颗粒状沉淀。阳性细胞超过肿瘤细胞数的10%定义为阳性，否则为阴性。结合临床资料，统计48例食管鳞癌患者癌组织Bmi-1表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、组织分化程度和淋巴结转移等临床特征的关系。

3 Real time PCR分析 按Trizol试剂盒提供的操作步骤提取10例正常食管组织和20例食管癌组织标本的总RNA。利用Invitrogen公司反转录试剂盒合成cDNA，具体操作按试剂盒说明书进行。根据Real time PCR试剂盒(TAKARA公司)与扩增仪(ABI5700型)说明，采用50μl反应体系(2×SYBR Premix Ex TaqTM 25μl，上游引物1μl，下游引物1μl，50×ROX Reference Dye 1μl，cDNA 溶液 4μl，DEPC H2O 18μl) 95℃ 预 变 性 180s；95℃ 20s，60℃ 60s，40个循环，利用比较CT法检测样本的mRNA表达情况。以正常食管黏膜为校正样本，其mRNA值设置为1，反应体系以甘油醛232磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参照，Bmi-1引物序列为：上游引物5'-TCATCCTTCTGCTGATGCTG-3'，下游引物5'-GCATCACAGTCATTGCTGCT-3' GAPDH引物序列为：上游引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。引物序列见文献[7]。

4 统计学处理 实验数据采用SPSS13.0统计分析软件分析，食管鳞癌临床病理参数与Bmi-1蛋白表达率之间的比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 食管癌组织中Bmi-1的表达增高 免疫组织化学结果显示，在食管鳞癌中Bmi-1蛋白呈高表达，癌旁组织中无表达或低表达(见图1)。食管鳞癌组织中Bmi-1阳性率为83.3%(40/48)，癌旁组织Bmi-18例表达，阳性率为16.6%(8/48)(P＜0.001)。Real time PCR进一步证实，食管癌组织中Bmi-1的mRNA表达显著高于其癌旁组织，与蛋白表达一致(见图2)。

2 Bmi-1蛋白的表达及与食管鳞癌患者临床病理参数的关系 Bmi-1高表达与组织分化程度和淋巴结转移有关(P＜0.05)，与年龄、性别、肿瘤大小无关(P＞0.05)。见表1。

表1 食管鳞癌组织中Bmi-1蛋白表达与临床特征的关系Tab 1 Relation between Bmi-1 protein expression and clinical characteristics of ESCC(n, %)

图1 Bmi-1蛋白在食管鳞癌组织中的免疫组织化学染色(×200)Fig.1 Immunohistochemixal staining showing Bmi-1 protein expression in ESCC tissues(×200)

图2 Real time PCR检测结果 1：食管癌组织；2：癌旁组织aP＜0.05，与食管癌组织比较Fig.2 RT-PCR showing Bmi-1mRNA in ESCC tissue and its adjacent tissue 1: esophageal squamous cell carcinoma tissues; 2: adjacent esophageal mucosa aP＜0.05, vs ESCC tissues

讨 论

人类Bmi-1基因位于第10号染色体短臂1区3带(10p13)，由十个外显子组成，cDNA全长3 251 bp，其开放阅读框编码的蛋白含有326个氨基酸，相对分子质量为44 000-46 000。Bmi-1是公认的一种原癌基因，它可协同c-myc共同作用，促进细胞转化和肿瘤形成[8]。

大量研究发现Bmi-1在多种肿瘤细胞中呈高表达，主要通过调节细胞周期在肿瘤发生发展中起重要作用，黄小杏[9]等运用免疫组化方法检测了Bmi-1在卵巢癌组织中的表达，发现Bmi-1在卵巢癌高表达，而在正常卵巢组织中无表达，Kaplan-Meier生存分析显示Bmi-1蛋白高表达卵巢癌患者生存时间明显低于低表达组，Kim等[10]检测了大肠癌及癌旁正常组织中Bmi-1基因的表达，发现大肠癌中Bmi-1 mRNA的表达较正常组织高2-3倍，且同时伴有p16蛋白的低表达，并认为Bmi-1基因通过抑制p16蛋白在肿瘤的发生发展中起重要作用。在我们的研究中发现48例食管鳞癌组织中有40例阳性表达，阳性率为83.3%；而癌旁组织中仅8例表达，阳性率为16.6%，Bmi-1阳性表达率与食管鳞癌患者年龄、性别、肿瘤大小无关(P＞0.05)；与组织分化程度和淋巴结转移有关(P＜0.05)，这表明Bmi-1参与食管鳞癌的发生发展过程。

本文从蛋白和基因转录水平研究了Bmi-1基因表达与食管癌临床病理特征的关系，结果表明Bmi-1基因在食管癌发生及预后过程中起重要作用，也为进一步阐明食管癌发生的分子机制提供了实验依据。同时检测Bmi-1对食管癌的早期诊断、治疗及预后判断有重要指导意义。

1 Zhang N，Yu C，Wen D，et al. Association of Nitrogen compounds in drinking water with incidence of esophageal squamous cell carcinoma in Shexian，China［J］. Tohoku J Exp Med，2012，226（1）：11-17.

2 刘天星，景丽，吕星晨，等．52例食管癌术后局部复发三维适形放射治疗分析［J］．军医进修学院学报，2011，32（11）：1115-1116．

3 Guo BH，Feng Y，Zhang R，et al. Bmi-1 promotes invasion and metastasis，and its elevated expression is correlated with an advanced stage of breast cancer［J］. Mol Cancer，2011，10（1）：10.

4 Zhang F，Sui L，Xin T. Correlations of BMI-1 expression and telomerase activity in ovarian Cancer tissues［J］. Exp Oncol，2008，30（1）：70-74.

5 Dong P，Kaneuchi M，Watari H，et al. MicroRNA-194 inhibits epithelial to mesenchymal transition of endometrial cancer cells by targeting oncogene BMI-1［J］. Mol Cancer，2011，10 ：99.

6 Cao L，Bombard J，Cintron K，et al. BMI1 as a novel target for drug discovery in Cancer［J］. J Cell Biochem，2011，112（10）：2729-2741.

7 于琦，孟秀香，袁宏，等. 实时荧光定量RT-PCR检测急性白血病中Bmi-1基因mRNA的表达及意义［J］. 大连医科大学学报，2010，32（1）：90-93.

8 Park IK，Morrison SJ，Clarke MF. Bmi1，stem cells，and senescence regulation［J］. J Clin Invest，2004，113（2）：175-179.

9 黄小杏，陈杰伟，李梅，等. Bmi-1在卵巢癌组织中的表达与临床病理意义［J］. 中山大学学报：医学科学版，2010，31（6）：862-866.

10 Kim JH，Yoon SY，Kim CN，et al. The Bmi-1 oncoprotein is overexpressed in human colorectal Cancer and correlates with the reduced p16INK4a/p14ARF proteins［J］. Cancer Lett，2004，203（2）：217-224.