具抗病毒活性的重组牛IFN-αA的冷激诱导表达与鉴定

孙旭燕，崔子寅，高明春，王君伟

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨 150030）

干扰素α（IFN-α）属于Ⅰ型干扰素，是一组能够诱导一系列细胞内蛋白表达继而发挥抗病毒、抗细胞增殖和调节免疫应答的细胞因子。自80年代初，人IFN-α基因被克隆报道后，鼠、狗、猪、牛和羊等哺乳动物的IFN-α基因也相继被克隆报道，牛α干扰素（BoIFN-α）的研究始于上世纪 80年代中期，研究表明BoIFN-α可以抵抗多种病毒的增殖与复制，因此日益为人们所重视。

E.coli表达系统是应用最广泛的表达系统之一。然而，BoIFN-α在E.coli表达系统中多以无生物学活性的包涵体形式存在。因此，利用E.coli表达系统表达出具有生物学活性的BoIFN-α更具生产与应用价值。本研究将BoIFN-αA亚型基因（BoIFN-αA）融合在易于表达的融合标签NusA末端[1]；同时利用内含肽元件（Ssp DnaB Mini-intein，SDI）介导的自我剪切反应自动去除融合标签，纯化重组蛋白[2]；应用冷激启动子表达系统降低蛋白质的合成速率，促进二硫键的正确装配，提高重组蛋白的可溶性表达[3]，构建内含肽-冷激表达重组质粒pColdⅢ-NusASDI-BoIFN-α，实现了 rBoIFN-αA的高效可溶性表达，为rBoIFN-α在我国实现规模化生产及临床应用提供有意义的依据。

1 材料和方法

1.1 病毒株、细胞、菌株及质粒 牛病毒性腹泻病毒（BVDV 1型NADL株）效价为TCID50=10-4.4/0.1m L、牛肾细胞（MDBK）细胞株、重组质粒pWL-BoIFN-α（IFN-α基因已经密码子优化，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成）[4]、E.coli感受态细胞TG1、DH5α、Rosetta以及 pET载体、pTW INⅠ、pColdⅢ均由东北农业大学动物医学学院微生物教研室保存。

1.2 主要试剂BsaⅠ、T4连接酶购自NEB公司；其他酶类购自TaKaRa公司；Bradford法蛋白质浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；……