微射流和超声波对长期贮藏大豆分离蛋白溶解性的影响

黄利华，黎海彬，彭述辉，陈 林

(广州城市职业学院食品系，广东广州510405)

大豆除了直接食用和作为食品加工的原辅料外，还是一种重要的油料作物［1］。而豆粕则是大豆榨油后的主要剩余物，因其蛋白质含量高达40%以上，从中提取大豆分离蛋白(SPI)是豆粕高值化利用的主要途径之一。SPI因其具有较好的营养性和功能特性而在食品加工中广泛应用，蛋白质良好的溶解性是应用其功能特性的前提和基础。SPI在贮藏中其溶解性一般会下降，究其原因可能是温度、湿度等外部环境影响蛋白质与蛋白质之间关联和蛋白质分子内部亲/疏水性质，最终反映蛋白质溶解性发生的变化［2－3］。蛋白溶解性的研究较多集中在利用理化手段修饰改性蛋白，使其能够和水分子较好结合。例如Jambrak A R等利用20、40、500Hz超声对 SPI溶液处理，40Hz的溶解性最高［4］，Chen L等利用双螺杆挤压 SPI，其溶解性明显提高［5］，涂宗财等［6］利用超高压均质处理SPI溶液，其溶解性随压力和蛋白浓度增加而升高，杨国龙等［7］用 Alcalase酶水解 SPI溶液，增强了SPI在水溶液中的扩散性。微射流是利用高压使蛋白溶液在交互容腔内产生剪切和冲撞，从而改变分子的排列和结构［8］。超声具有波动和能量的双重属性，对于难溶性蛋白的分离制备具有较好效果［9］。目前对贮藏条件下蛋白溶解性的变化缺乏系统研究，本研究将微射流结合超声技术，提高不同贮藏期内SPI溶解性，从而有助于提升SPI功能特性，为拓展较长贮藏时间的大豆蛋白应用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

豆粕(脱脂白豆粕片)山东日照;Mark、尿素、牛血清蛋白 Sigma;β－巯基乙醇(化学纯)、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、尿素、磷酸二氢钠、氢氧化钠、盐酸等 均为国产分析纯。

M－110L高压纳米微射流均质机 美国MFIC公司;JY92－2D型超声细胞粉碎机 上海新诺公司;WATERS高效液相 美国WATERS公司;F－3000紫外－可见分光光度计 日本HITACHI公司;Zetasizer Nano ZS纳米激光粒度仪 英国Malvern公司;AR－1500流变仪 美国 AR公司;Avanti J－26XP离心机 德国BECKMAN公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大豆分离蛋白的制备和贮藏 采用常用的碱溶酸沉法制备大豆分离蛋白。粉碎脱脂豆粕，过80目筛，豆粕粉与水1∶10(w/v)，用1mol/L的NaOH调pH至8.0，30℃搅拌1.5h，在搅拌过程中始终维持pH为8.0，将溶液在4℃离心(10000×g，30min)，取上清液。用1mol/L HCl将上清液pH调至4.5，30℃下搅拌30min，然后在 4℃ 离心(12000 × g，10min)，取沉淀。将沉淀复溶，再次离心沉淀。将沉淀按1∶5(w/v)加水复溶，调pH至7.0，在4℃水中透析24h，每4h换一次水，将透析后SPI溶液调整浓度后冷冻干燥，塑封袋密闭后于室温下置于干燥皿中贮藏。

1.2.2 微射流结合超声波处理SPI溶液 根据前期实验的结果，设置纳米微射流均质机的输出压力为17400psi，即约为120MPa，浓度为5%的 SPI溶液通过微射流均质1次。将通过微射流的SPI溶液放入超声细胞粉碎机内，操作功率500W，超声探头插入液体下面3cm，采用工作5s，间歇5s的方式，该操作方式通过不断反复的振荡，蛋白的溶解效果好于连续式振荡。

1.2.3 凝胶电泳(SDS－PAGE)分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为4%。样品制备:蛋白样品溶于SDS－PAGE 样品缓冲液(0.125mol/L Tris－HCl缓冲液，含 1%(w/v)SDS、2%(v/v)巯基乙醇、5%(v/v)甘油和0.025%(w/v)溴酚蓝，电泳前煮沸5min。上样量为10μL，凝胶电泳于恒流模式下进行，在浓缩胶中电流40mA，进入分离胶后增至80mA。凝胶染色液采用0.25%考马斯亮蓝(R－250)溶液，脱色采用高甲醇的醋酸溶液，甲醇/冰乙酸/去离子水按 227∶37∶236(v/v/v)。

1.2.4 溶解性测定 蛋白质的溶解度测定根据Petrucelli S等报道的方法［10］，稍加改动，测量处理后溶液中的可溶性蛋白含量。称取不同贮藏时间和微射流处理的蛋白样品100mg，分散于10mL的去离子水中，室温下磁力搅拌30min，然后用1mol/L NaOH或HCl溶液调节溶液的pH到7.0，再搅拌30min后，在20℃离心(12000×g，20min)。上清液经过适度稀释后，采用福林酚法测定蛋白质含量，以牛血清白蛋白(BSA)为标准物做标准曲线。蛋白质的溶解度为上清液蛋白浓度占总蛋白浓度的百分比，每个样品重复测量3次。

1.2.5 凝胶排阻色谱 凝胶排阻色谱(SEC－HPLC)条件如下:WATERS 2487高效液相泵和1525紫外检测器组成的 WATERS高效液相系统，采用 TSK G4000SW作为分析柱，洗脱液为50mmol/L磷酸缓冲溶液(pH 7.2，50mmol/L NaCl)，流速为0.8mL/min。洗脱液经滤膜后(0.45μm)，再超声脱气。膜滤后的蛋白溶液(2mg/mL)上样于TSK G4000SW柱(进样量为 20μL)，采用恒流洗脱。以蓝色葡聚糖(2000ku)、伴清蛋白(75ku)、醛缩酶(158ku)、铁蛋白(440ku)和甲状腺球蛋白(669ku)的洗脱时间绘制标准曲线。

1.2.6 浊度测定 将不同保藏期和经微射流结合超声处理的SPI蛋白溶液稀释至浓度为0.5%wt，溶剂分别为S1:水溶液(pH7.0);S2:pH7.0缓冲液(0.05mol/L的Tris－HCl，6mol/L 尿素和 10mmol/L 的 β－ 巯基乙醇)。把上述各种SPI蛋白溶液分别在600nm测吸光度，每个样品测量3次。

1.2.7 粒度测定 加热处理前先将不同保藏期和经微射流结合超声处理的SPI蛋白溶液通过0.45μm膜过滤，然后将处理的样品稀释成浓度为0.1%，在85℃下加热10min，将样品液加入到比色皿中。常温测量是在25℃条件下进行，对比蛋白聚集粒度的变化，每个样品分别测量3次。

1.2.8 数据统计分析 采用SPSS 17.0软件和Excel 2003软件进行统计分析、数据处理和绘图。

2 结果与分析

2.1 超声处理对可溶性蛋白的影响

将浓度5%贮藏360d的SPI溶液分别通过功率为 200、350、500、650、800W 的超声处理 10min，结果如图1所示，超声处理能显著提高SPI可溶性蛋白含量，可溶性蛋白含量随超声功率的加大而逐渐增加，但在功率500W以后其增幅减弱，统计学上无显著差异(p＞0.05)。

图1 超声功率对可溶性蛋白的影响Fig.1 Effect of ultrasonic power on soluble protein

将浓度5%贮藏360d的SPI溶液分别通过功率为500W 超声处理5、10、15、20、25min，结果如图2 所示，延长超声时间同样也增加可溶性蛋白含量，但在15min以后其增幅减弱，20、25min的结果已无显著差异(p＞0.05)。

超声波具有能量和波动的双重性，使蛋白溶液中产生的空化、剪切和热作用，以致使蛋白质的肽链结构变得疏松，增强了与水分子结合能力，从而提高可溶性蛋白含量。超声波还可使蛋白分子产生高速振荡，改变了蛋白质的构象和结构，使亲水性氨基酸残基暴露，增强蛋白质的亲水性［11］。

图2 超声时间对可溶性蛋白的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on soluble protein

2.2 微射流均质对蛋白质溶解性的影响

将浓度5%贮藏360d的SPI溶液分别通过微射流压力4000、8000、12000、16000psi的微射流均质 1次和2次，结果如图3所示，可溶性蛋白含量随压力的增大而逐渐增大，而通过第2次均质后可溶性蛋白含量有所下降。微射流均质是利用高压使蛋白溶液在交互容腔内产生剪切和冲撞，从而改变分子的排列和结构，达到增加蛋白溶解性的目的［8］。微射流结合超声波处理改变了蛋白的分子结构，增加了蛋白分子与水分子的结合能力，使可溶性蛋白含量增加。第2次通过微射流均质使蛋白疏水基团更多暴露，从而减弱了蛋白与水的结合能力，降低其溶解性。

图3 微射流均质次数对可溶性蛋白的影响Fig.3 Effect of homogeneous times of microfluidization on soluble protein

2.3 微射流和超声波对SPI溶解性的影响

将4份SPI在同等条件下贮藏，分别在0、120、240、360d取出测量SPI溶液中可溶性蛋白的含量。如图4所示，在0～360d的范围内，随着贮藏时间的延长，SPI可溶性蛋白含量显著下降(p＜0.05)，将贮藏360d的SPI分别通过微射流和超声波处理(MF+U)，蛋白分子去折叠化，也增加了蛋白分子的扩散性和亲水性，SPI的可溶性蛋白含量也从0d的59.5%±1.2%降低到360d的43.3% ±1.6%。而经过微射流和超声波处理后，SPI可溶性蛋白含量(88.1% ±1.3%)显著提高。可溶性蛋白含量的提高理论上同样促进蛋白的乳化性、持水性和持油性等功能性质的提高［12－13］。

2.4 SPI的凝胶电泳图谱

图4 不同贮藏期SPI的溶解性Fig.4 Solubility of SPI in different storage periods

图5所示贮藏期为0、120、240、360d的 SPI凝胶电泳图谱。不同贮藏期的SPI中各组分亚基发生变化，小分子量组分明显增多，常温贮藏条件下SPI理化性质逐渐发生改变，蛋白质分子去折叠，分子内部的结构发生变化。大豆球蛋白(glycinin)的疏水性碱性亚基部分(B)逐渐增多，增加了其不溶部分含量。将贮藏360d的SPI溶液通过微射流和超声波处理，在高压高剪切的环境中，其碱性亚基减少，蛋白的亲水性增强，溶解性提高。大豆球蛋白和β－伴球蛋白的亚基解离，不同亲/疏水性亚基的暴露改变了包括溶解性在内的性质［14］。

图5 SPI各组分的SDS－PAGE图Fig.5 SDS－PAGE of SPI components

2.5 SPI的凝胶色谱图

不同贮藏期的SPI和通过微射流结合超声处理蛋白的凝胶排阻色谱图如图6所示，主要的洗脱峰出现在15min以内，贮藏期为0～360d的SPI，峰形和出峰时间变化趋势近似。但是，从图中也发现主峰面积和出峰时间并没有明显的规律。可能是SPI中亚基在贮藏过程中既存在解聚，同时也存在聚合［5］。而通过微射流和超声处理的SPI溶液，其主峰峰面积减少，可能是蛋白疏水聚集减少，蛋白易发生水合作用，有利于蛋白溶解性的提高。

图6 不同贮藏期和处理后SEC－HPLC图谱Fig.6 SEC－HPLC of SPI in different storage periods and treatment

2.6 微射流和超声波对SPI聚集粒径影响

蛋白的粒径反映了在溶液中的扩散情况，贮藏期0～360d的SPI在85℃下加热10min蛋白聚集程度的粒度分布情况如图7所示，溶液中的蛋白聚集粒径随贮藏时间延长，聚集的粒径也增大。在360d贮藏后，SPI的热聚集甚至出现了双峰粒径(255nm)。而通过微射流和超声处理的SPI其粒径最小(21nm)，其分布范围也更加集中，显著改变了贮藏360d SPI粒径的双峰模式。这一结果与微射流处理蛋白粒径变化趋势相一致［15］。

图7 不同贮藏期和处理后SPI聚集的粒度Fig.7 Aggregation size of SPI in different storage periods and treatment

2.7 微射流和超声波对SPI聚集浊度影响

图8显示了在600nm波长下不同SPI溶液中的浊度分析，反映了不同处理条件下蛋白悬浮液的透光率。S1溶液为水溶液，显示了SPI热聚集在可见光下的透光率。不管是S1的水溶液中还是S2的缓冲液中，贮藏期0～360d的范围内，SPI溶液的浊度随贮藏时间延长而逐渐增大，溶液中蛋白的聚集程度越来越强。而经过微射流和超声波处理，蛋白溶液的浊度明显下降，吸光度下降，透光率提高。

图8 不同溶剂中SPI溶液浊度Fig.8 Turbidity of SPI in different solvent

S2缓冲液中存在尿素和巯基乙醇，尿素破坏了蛋白的许多疏水键和氢键等非共价键，使蛋白的溶解性增加。巯基乙醇则破坏蛋白分子内二硫键等共价键，S2缓冲液中的浊度与S1比较明显下降，可以推测溶液中SPI生成聚集主要是疏水键和氢键等非共价键起连接作用。

3 结论

通过实验明确了在常温密闭贮藏条件下，SPI的溶解性随着贮藏时间的延长而逐渐下降，可溶性蛋白含量从贮藏0d的59.5% ±1.2%降低到360d的43.3%±1.6%。凝胶电泳图谱和排阻色谱显示SPI在贮藏期0～360d内，SPI亚基等成分发生解聚，SPI聚集的粒径随贮藏时间延长而变大，分布范围更宽，SPI聚集溶液浊度分析也显示随贮藏时间延长溶液浊度值更高。经过微射流和超声波双重处理，SPI可溶性蛋白含量上升到88.1%±1.3%。凝胶排阻色谱波峰显示SPI中亲水性变化，SPI聚集的粒径显著下降，SPI聚集的浊度在水溶液中要显著高于尿素和巯基乙醇的缓冲液，SPI聚集主要是由非共价键连接。

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