阿魏酸钠对脂多糖引起的大鼠海马炎症反应的抑制作用及其机制探讨

闫恩志， 范 莹， 隋海娟， 刘婉珠， 刘 卓， 金 英*

(1.辽宁医学院药理学教研室，辽宁锦州 121001;2.辽宁医学院机能实验中心，辽宁锦州 121001)

老年斑和神经纤维缠结是阿尔茨海默病的主要病理改变［1］，胶质细胞激活及细胞因子的释放能促进老年斑及神经纤维的缠结，研究发现这一炎症反应过程与阿尔茨海默病患者病情进展相关［2-3］，丝裂原活化蛋白激酶P38(p38MAPK)信号通路是重要的哺乳动物细胞应激信号传导通路之一，有研究表明p38MAPK信号通路的激活能促使单核、巨噬细胞白介素-1β(IL-1β)的产生，进而损伤神经元［4-5］，在阿尔茨海默病病人脑内也发现磷酸化p38MAPK表达明显增加［6］，放大脑内的炎症反应［7］。阿魏酸钠具有抗氧化、抗自由基及抗炎等药理作用，研究发现阿魏酸钠能保护老年大鼠海马神经元损伤，改善大鼠的学习记忆障碍［8］，本研究通过大鼠脑室内注射脂多糖建立炎症反应模型，研究阿魏酸钠对神经元保护作用是否与抑制p38MAPK信号传导通路有关。

1 材料与方法

1.1 动物 Sprague-Dawley大鼠，体质量250 g，雄性，动物合格证号:SCXK(辽)2003-0007，由辽宁医学院动物实验中心提供。

1.2 药品和试剂 阿魏酸钠 (苏州畅通有限公司，纯度大于99%)，脂多糖购于北京邦定泰克生物技术公司 (纯度95%)。磷酸化丝裂原活化蛋白激酶 3/6抗体 (MKK3/MKK6) (Ser189/207，#9231)， 磷 酸 化 p38MAPK (Thr180/Tyr182，#9211)，磷酸化活化转录因子-2(ATF-2)(Thr71，#9221)，均为兔抗人多克隆抗体，购于Cell Signaling公司 (Beverly，MA，USA)。兔诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)、兔白介素-1β(IL-1β)多克隆抗体、碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG购于Santa Cruz公司;TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0购于宝生物工程有限公司 (中国大连);Trizol试剂购于美国Invitrogen公司;β-肌动蛋白和NBT/BCIP显色液购于碧云天试剂公司。

1.3 动物分组及模型建立 SD大鼠随机分为对照组、模型组、阿魏酸钠组 (100、200 mg/kg)。阿魏酸钠组大鼠灌胃给予不同剂量阿魏酸钠 (100、200 mg/kg)1.0 mL，对照组、模型组大鼠灌胃等量生理盐水。连续灌胃给药3周后，大鼠麻醉固定在立体定位仪上，模型组、阿魏酸钠组无菌条件下将5 μL脂多糖1.0 mmol/L恒速注射到左侧脑室内，对照组注射等量生理盐水。

1.4 Western blot检测 大鼠麻醉，快速取海马CA1区，按前述方法进行IL-1β、诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)、磷酸化的 MKK3/MKK6、p38MAPK、ATF-2蛋白测定［9］，简言之，SDS-PAGE电泳后转膜，加入一抗4℃过夜，二抗孵育2 h(所有抗体均1∶500稀释)，避光显色，扫描图像，应用Window AlphaEase TM FC 32-bit软件 (Alpha Innotech Corporation，San Leandro，CA，USA)进行灰度值分析。

1.5 RT-PCR检测 取大鼠海马CA1区组织，进行IL-1β和iNOS的mRNA表达测定，引物序列及实验过程按前述方法进行［10］，扩增后产物进行凝胶电泳，扫描图像，利用Window AlphaEase TM FC 32-bit软件进行灰度值分析。

2 结果

2.1 阿魏酸钠对脂多糖引起的IL-1β表达增加的抑制作用 Western blot和RT-PCR实验结果显示与对照组相比脑室注射脂多糖能引起IL-1β蛋白和mRNA表达明显增加 (P＜0.01)，阿魏酸钠(100、200 mg/kg)对IL-1β蛋白及mRNA表达增加具有明显的抑制作用 (P＜0.01)(图1，图2，表1)。

图1 阿魏酸钠对脑室内注射脂多糖所致的大鼠海马CA1区IL-1β蛋白表达的影响Fig.1 Effect of sodium ferulate on the expression of IL-1β protein after intracerebroventricularly being injected LPS in rat hippocampus CA1 regions

图2 阿魏酸钠对脑室内注射脂多糖所致的大鼠海马CA1区IL-1β mRNA表达的影响Fig.2 Effect of sodium ferulate on the expression of IL-1β mRNA after intracerebroventricularly being injected LPS in rat hippocampus CA1 regions

2.2 阿魏酸钠对脂多糖引起iNOS表达增加的抑制作用 Westernblot和RT-PCR实验结果显示与对照组相比脑室注射脂多糖能引起iNOS蛋白和mRNA表达明显增加 (P＜0.01)，阿魏酸钠 (100、200 mg/kg)对iNOS蛋白及mRNA表达水平增加具有明显抑制作用 (P＜0.01)(图3，图4，表1)。

图3 阿魏酸钠对脑室内注射脂多糖所致的大鼠海马CA1区iNOS蛋白表达的影响Fig.3 Effect of sodium ferulate on the expression of iNOS protein after intracerebroventricularly being injected LPS in rat hippocampus CA1 regions

图4 阿魏酸钠对脑室内注射脂多糖所致的大鼠海马CA1区iNOS mRNA表达的影响Fig.4 Effect of sodium ferulate on the expression of iNOS mRNA after intracerebroventricularly being injected LPS in rat hippocampus CA1 regions

表1 阿魏酸钠对脂多糖诱导的海马CA1区IL-1β、iNOS蛋白和mRNA表达影响的灰度值分析结果 (±s，n=3)Tab.1 Effects of sodium ferulate on LPS-induced the expression of IL-1β，iNOS protein and mRNA in rat hippocampus CA1 regions(±s，n=3)

表1 阿魏酸钠对脂多糖诱导的海马CA1区IL-1β、iNOS蛋白和mRNA表达影响的灰度值分析结果 (±s，n=3)Tab.1 Effects of sodium ferulate on LPS-induced the expression of IL-1β，iNOS protein and mRNA in rat hippocampus CA1 regions(±s，n=3)

注:与对照组相比，＊＊P＜0.01;与模型组相比，##P＜0.01。

组 别IL-1β蛋白/β-Actin IL-1β mRNA/β-Actin iNOS蛋白/β-Actin iNOS mRNA/β-Actin对照组 0.237±0.035 0.353±0.023 0.162±0.019 0.423±0.011模型组 0.715±0.072＊＊ 0.867±0.075＊＊ 0.753±0.066＊＊ 1.112±0.077＊＊阿魏酸钠100 mg/kg组 0.435±0.031## 0.387±0.033## 0.198±0.015## 0.513±0.021##阿魏酸钠200 mg/kg组 0.419±0.025## 0.315±0.029## 0.176±0.013## 0.465±0.025##

2.3 阿魏酸钠抑制脂多糖引起的p38MAPK信号传导通路相关蛋白表达增加 侧脑室注射脂多糖后，大鼠海马 CA1区磷酸化 MKK3/MKK6、磷酸化p38MAPK、磷酸化ATF-2蛋白表达水平较生理盐水对照组明显增加 (P＜0.01)。阿魏酸钠 (100、200 mg/kg)可明显对抗脂多糖引起的磷酸化MKK3/MKK6、磷酸化p38MAPK、磷酸化ATF-2蛋白表达水平增加 (P＜0.01)(图5，图6，图7，表2)。

3 讨论

p38MAPK信号传导通路能够将细胞外刺激与细胞内转录和基因表达连接起来，是介导阿尔茨海默病病人脑内炎症反应的重要通路之一，细胞外刺激激活 MKK3/MKK6，进而激活位于胞质内的p38MAPK［7，11］，活化的 p38MAPK 可进一步激活位于细胞核内的多种转录因子，启动基因转录活化，合成一些细胞因子及促凋亡蛋白，从而参与诱导神经元的损伤和凋亡［12-13］。本研究结果显示大鼠脑室内注射脂多糖上调了磷酸化的 MKK3、MKK6、p38MAPK及ATF2的表达，说明p38MAPK信号传导通路介导了脂多糖诱导的大鼠脑内的炎症反应过程。

图5 阿魏酸钠对脑室内注射脂多糖所致的大鼠海马CA1区磷酸化MKK3/MKK6蛋白表达的影响Fig.5 Effect of sodium ferulate on the expression of p-MKK3/MKK6 protein after intracerebroventricularly being injected LPS in rat hippocampus CA1 regions

图6 阿魏酸钠对脑室内注射脂多糖所致的大鼠海马CA1区磷酸化p38MAPK蛋白表达的影响Fig.6 Effect of sodium ferulate on the expression of p-p38MAPK protein after intracerebroventricularly being injected LPS in rat hippocampus CA1 regions

图7 阿魏酸钠对脑室内注射脂多糖所致的大鼠海马CA1区ATF-2蛋白表达的影响Fig.7 Effect of sodium ferulate on the expression ofATF-2 protein after intracerebroventricularly being injected LPS in rat hippocampus CA1 regions

表2 阿魏酸钠对脂多糖引起的大鼠海马CA1区磷酸化MKK3/MKK6、磷酸化p38MAPK、磷酸化ATF-2蛋白表达灰度值分析结果Tab.2 Effects of sodium ferulate on LPS-induced the increase of p-MKK3/MKK6，p-p38MAPK and p-ATF-2 protein level in rat hippocampus CA1 regions(±s，n=3)

表2 阿魏酸钠对脂多糖引起的大鼠海马CA1区磷酸化MKK3/MKK6、磷酸化p38MAPK、磷酸化ATF-2蛋白表达灰度值分析结果Tab.2 Effects of sodium ferulate on LPS-induced the increase of p-MKK3/MKK6，p-p38MAPK and p-ATF-2 protein level in rat hippocampus CA1 regions(±s，n=3)

注:与对照组相比，＊＊P＜0.01;与模型组相比，##P＜0.01。

组 别 磷酸化MKK3蛋白/β-Actin磷酸化MKK6蛋白/β-Actin磷酸化p38MAPK蛋白/β-Actin磷酸化ATF-2蛋白/β-Actin对照组 0.155±0.013 0.149±0.012 0.311±0.023 0.156±0.015模型组 0.597±0.015＊＊ 0.537±0.046＊＊ 0.635±0.025＊＊ 0.644±0.029＊＊阿魏酸钠100 mg/kg组 0.121±0.022## 0.117±0.013## 0.392±0.078## 0.347±0.038##阿魏酸钠200 mg/kg组 0.129±0.016## 0.125±0.019## 0.173±0.027## 0.371±0.031##

p38MAPK信号传导通路具有放大脑内炎症反应的作用，研究发现在老年斑周围聚集了大量的小胶质细胞和星形胶质细胞［2-3］，能够释放NO、IL-1β等炎症因子［15］。释放的IL-1β等炎症因子激活位于胞质内的p38MAPK，活化的p38MAPK迅速移位到细胞核，激活转录因子，促使包括IL-1β和TNF-α等与凋亡相关的炎症介质进一步释放［14-15］，IL-1β的大量释放又可进一步激活p38MAPK通路，加剧炎症反应［16］。NO主要由诱导型一氧化氮合酶(iNOS)合成，研究发现iNOS的产生在IL-1β之后，且具有IL-1β依赖性，IL-1β表达增加后可通过p38MAPK通路增加星形胶质细胞和小胶质细胞iNOS和环氧化酶表达，iNOS能够持续大量的催化NO产生，在病理情况下，大量合成的NO与氧自由基反应后再与蛋白中的酪氨酸残基作用，产生硝基酪氨酸，硝基酪氨酸可以破坏细胞膜完整性、抑制线粒体酶活性、损伤DNA结构以及激活凋亡，从而参与阿尔茨海默病疾病进程［17］。

本实验也从基因转录和蛋白表达水平上证实大鼠脑室内注射脂多糖能上调了IL-1β和iNOS表达，采用大鼠灌胃给予阿魏酸钠100、200 mg/kg剂量，结果发现阿魏酸钠在抑制p38MAPK信号传导通路相关蛋白表达的同时，也抑制了IL-1β和iNOS表达的增加，说明阿魏酸钠可通过抑制p38MAPK通路发挥抗炎抗氧化损伤作用，但阿尔茨海默病脑内炎症病变是多重信号传导通路共同作用的结果，阿魏酸钠是否还存在其他作用还需进一步的研究。

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