实时荧光P C R在人乳头瘤病毒临床检测中的应用

胥 文

山东省莱芜钢铁集团有限公司医院检验科，山东莱芜 271126

大量的临床研究报道证实人乳头瘤病毒（HPV）是导致女性宫颈癌和癌前病变的主要病毒，调查显示宫颈癌患者的标本HPV检出率已经超过了90%，因此做好人乳头瘤病毒的检查诊断对宫颈疾病的预防和治疗有着极其重要的临床价值[1]。国际癌症组织对世界多个国家地区的宫颈癌进行了调查研究，发现该类病毒主要有15种高危型DNA，HPV16、HPV18和HPV58是我国最为常见的三种高危型病毒[2]。目前第二代杂交捕获法是检测HPV的主要方法，随着生物技术的进步发展，实时荧光PCR技术的出现为DNA的临床检测提供了简便和快捷。本次研究主要对第二代杂交捕获法和实时荧光PCR的检测结果进行了比较分析，以期为临床诊断HPV提供参考，现总结如下：

1 资料与方法

1.1 研究对象

随机选取2010年10月～2011年10月于本院妇产科接受诊治的人乳头瘤病毒感染患者102例，年龄24～60岁，平均（34.8±2.6）岁；临床细胞检查结果：低度鳞状上皮细胞内病变患者40例，高度鳞状上皮内病变患者16例，不典型鳞状细胞46例；所有患者均无其他严重的生殖系统疾病，本次检查已征得患者的同意。

1.2 试剂和仪器

本次试验所用的主要试剂盒器材如下：美国Digene公司提供HPV-DNA试剂盒、HCⅡ基因杂交信号扩大系、子宫颈采样器，Xygen公司提供的微孔板封面胶膜和圆底96孔酶标板；上海复星诊断公司提供的高危型HPV实时荧光PCR试剂盒和实时荧光PCR仪（Line-Gene FQIN33 A型）。

1.3 试验方法

采取对照性试验进行分析探讨，分别使用第二代杂交捕获法（HCⅡ）和实时荧光PCR对102例患者的标本进行检测，结合患者的病理资料对两种检测方法的结果进行比较分析。

1.4 检测方法

1.4.1 第二代杂交捕获检测 本方法可对13种高危型HPV进行同步检测，根据试剂盒说明书进行相应的试验操作，首先是对标本DNA解链，将解链后的单链DNA与RNA探针杂交，得到DNA-RNA的杂交体，杂交体可同微孔壁特异性抗体进行结合，磷酸化抗体后信号放大，底物经碱性磷酸酶作用后发光，通过发光的强弱来对微孔壁上磷酸酶含量进行测定，最后获得特异性结合杂交体含量。如果HPV负荷量超过1.0 pg/mL则可判定为发生 HPV阳性感染。

1.4.2 实时荧光PCR检测 不同探针和引物（3'端和5'端分别标有荧光淬灭基团和荧光报告基团）需要在特异性碱基区和模板作用，Taq酶能够将探针降解，此时荧光报告基团可以摆脱荧光淬灭基团，增强荧光信号，通过定量PCR仪动态检测标本荧光信号，确定其型别。实时荧光PCR剂盒也可对13种高危型HPV型进行检测，其操作流程主要根据试剂盒说明书实施，大概步骤：样本DNA的提取-实时荧光PCR反应液的配置-样本实时荧光PCR扩增和检测-根据荧光值判定反应结。

1.5 统计学方法

所得数据采用SPSS 12.0统计软件进行分析处理，计量资料用±s表示，采用t检验或χ2检验对相关数据进行比较分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同程度宫颈病变的HPV阳性检出率

病理资料显示本组病例中宫颈上皮内瘤变（CIN）的有38例，慢性宫颈炎和鳞状上皮病变的36例，HCⅡ和实时荧光PCR对CIN的HPV阳性检出率分别为86.84%和94.74%，对慢性宫颈炎和鳞状上皮病变的阳性检出率分别为36.11%和58.33%，具体比较情况见表1。

表1 两种方法不同程度宫颈病变的HPV阳性检出率比较[n（%）]

2.2 HPV的阳性检出率和符合率

HCⅡ的HPV总阳性检出率为62.75%，实时荧光PCR的为71.57%，两组比较差异具有统计学意义（χ2=3.46，P＜0.05），两种方法的总符合率为82.35%，具体比较情况见表2。

表2 两种方法的阳性检出率比较

2.3 CIN的临床检测

根据患者的病理检查结果对CINⅡ和CINⅢ的检测结果进行比对发现两种手段在高危型宫颈病变的检测具有较好的相关性，实时荧光PCR的灵敏性和特异性要略好于HCⅡ。

3 讨论

3.1 人乳头瘤病毒

目前的临床研究[3-4]发现人乳头瘤病毒基因型有100余种，和生殖道感染相关的占到了40%，和肿瘤发生相关的占了20%，根据其致病能力的异同可将该类病毒分为高危型病毒和低危型病毒，该病毒和女性宫颈癌的发生有着极为密切的关系。低危型病毒可能导致湿疣和宫颈上皮内发热低度病变，高危型人乳头瘤病毒具有较高的致癌能力，主要包括HPV16、HPV18，已有的一些研究已经证实宫颈癌组织标本该类病毒的阳性检出率超过90%，因此做好其诊断检查对临床治疗具有重要的意义[5]。

3.2 两种检测方法

临床研究[6-7]证实第二代杂交捕获检测对HPV具有较好的临床检测效果，随着医疗诊断技术的不断发展和进步，实时荧光PCR技术逐渐应用于临床检测。本研究对第二代杂交捕获检测和实时荧光PCR技术的检测结果进行了比较，两者的符合性达到82.35%，结果证明两种手段在高危型宫颈病变的检测具有较好的相关性；实时荧光PCR的灵敏性和特异性要略好于第二代杂交捕获检测，本次研究结果中实时荧光PCR总阳性检出率也要显著好于第二代杂交捕获检测，且对慢性宫颈炎和鳞状上皮病变的HPV的检测效率要显著好于第二代杂交捕获检测，这些结果说明此种检测方法对于临床检测和诊断HPV具有较好的效果，可以作为一种有效的检测手段来对此种病毒诊断，实时荧光PCR的操作简便有效，在缩短检测时间的同时，大大提高了对人乳头瘤病毒的诊断的有效性[8]。

综上所述，实时荧光PCR和第二代杂交捕获法都是临床上检测人乳头瘤病毒的有效方法，两者的HPV诊断相关性较高，实时荧光PCR具有较好的灵敏性和特异性，提高了诊断准确性，为宫颈类疾病的早发现和治疗提供了可靠的依据。

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