天然奶味香精的酶解工艺优化

田怀香 李凤华 马 霞

（上海应用技术学院香料香精技术与工程学院，上海 201418）

目前，化学合成的奶味香精在市场上占有着重要的地位，然而随着人们生活水平的提高和对天然与健康的关注，天然奶味香精越来越得到人们的青睐［1］。因此，寻求一种新的、有效的方法来生产天然高质量的奶味香精是广大科研工作者致力研究的方向。基于脂肪酶作用于乳脂可以产生脂肪酸，赋予奶制品独特的奶香风味，酶法水解奶油及奶制品成为一个有效方法［2］。此法能产生具有奶香特征的天然奶味香精，其香气自然、柔和，奶香强度以150～200倍增加。1983年日本长谷川公司公布了利用脂肪酶处理食用油、脂肪、糖和氨基酸生产奶香料的专利［3］。Verhaeghe等［4］通过从Rhizopus arrhizus中获得的脂肪酶来水解黄油、奶油和人造奶油，武彦文等［5］利用脂肪酶Palatase水解奶油，得到的水解产物香气自然，柔和，对加香产品的内在质量有明显的改善和提高。黄汉荣等［6］将酶法和氧化热裂解反应相结合，以奶油为原料，利用优选的脂肪酶，使奶油中的部分甘油三酯水解出游离脂肪酸，然后以该产物进行氧化热裂解，制得增香型奶香料。

为了获得良好的乳脂肪风味，可以以稀奶油、奶油或无水奶油为原料，利用脂肪酶对乳脂肪进行适度水解制取奶油酶解产物。所得到的奶油酶解产物再经过适当修饰，其香气自然、柔和，且留香持久［7］，这是单体香料调配而成的同类乳品香精所达不到的。而且酶法生产乳品香精纯度高、安全性好，因而具有极大的应用价值。但是产品的香气受酶解工艺的影响很大，本研究结合单因素试验和响应面分析对制备天然奶味香精的酶解工艺进行优化，为企业规模化生产和产品的质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 原料与仪器

稀奶油：食品级，上海光明乳业；

其他药品试剂：分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司；

超级恒温水浴：601型，上海森地科学仪器有限公司；

pH计：Delta 320型，梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司；

恒温磁力搅拌器：524G型，上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；

数显恒温水浴锅：HHS型，金坛市岸头国瑞实验仪器厂；

电子天平：BS124S型，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；

高剪切分散乳化机：FA25型，弗鲁克公司（FLUKO）。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程

奶油→加乳化剂→加水→高速均质机搅拌、乳化→巴氏杀菌→冷却→调pH→添加脂肪酶→水解→灭酶→感官评定

1.2.2 单因素试验

（1）酶添加量对酶解反应的影响：称取10.0g稀奶油，0.150g单硬脂酸甘油酯，加入50.0mL蒸馏水，温度为50.0℃，酶解时间为4.00h，pH 为7.80，酶添加量分别为原料奶油的350，450，550，650，750，850，950U／g·稀奶油，进行酶解反应。

（2）乳化剂种类对酶解反应的影响：称取10.0g稀奶油，加入50.0mL蒸馏水，温度为50.0℃，酶解时间为4.00h，酶添加量为550U／g·稀奶油，pH 为8.00，乳化剂分别为span60、单硬脂酸甘油酯、tween60，进行酶解反应。

（3）乳化剂使用量对酶解反应的影响：称取10.0g稀奶油，加入50.0mL蒸馏水，温度为50.0℃，酶解时间为3.50h，酶添加量为550U／g·稀奶油，pH 为8.00，乳化剂为单甘酯，乳化剂的使用量分别为0.050，0.100，0.150，0.200，0.250g，进行酶解反应。

（4）底物浓度对酶解反应的影响：底物浓度分别设置为20%，40%，50%，60%，80%，100%，加入0.150g单硬脂酸甘油酯，温度为60.0℃，酶解时间为3.50h，pH 为8.00，酶添加量为550U／g·稀奶油，进行酶解反应。

（5）pH 对酶解反应的影响：称取10.0g稀奶油，0.150g单硬脂酸甘油酯，加入50.0mL蒸馏水，温度为50.0℃，酶添加量为550U／g·稀奶油，酶解时间为4.00h，pH 分别为6.00，6.50，7.00，7.50，8.00，8.50，9.00，进 行 酶解反应。

（6）酶解温度对酶解反应的影响：称取10.0g稀奶油，0.150g单硬脂酸甘油酯，加入50.0mL蒸馏水，酶添加量为550U／g·稀奶油，pH为8.00，酶解时间为3.50h，反应温度分别为40.0，45.0，50.0，55.0，60.0，65.0，70.0 ℃，进行酶解反应。

（7）酶解时间对酶解反应的影响：称取10.0g稀奶油，0.150g单硬脂酸甘油酯，加入50.0mL蒸馏水，温度为50.0℃，酶添加量为550U／g·稀奶油，pH 为8.00，酶解时间分别为2.50，3.00，3.50，4.00，4.50，5.00h，进行酶解反应。

1.2.3 感官评定 运用九点快感标度法对水解产物的香气风味和香气强度进行感官品评，并对各组感官结果评分，评分标准见表1。

2 结果与讨论

2.1 单因素酶解工艺研究

影响酶解反应的因素有酶添加量、乳化剂种类、乳化剂使用量、底物浓度、pH、酶解温度和酶解时间。酶解反应以感官评定为主要指标、奶油脂解率为辅助指标，通过单因素试验得到：当酶添加量为550U／g稀奶油、乳化剂为单硬脂酸甘油酯、单甘酯使用量为稀奶油的1.50%、底物浓度为40.0%、pH 为8.00、酶解温度为60.0℃、酶解时间为3.50h时，酶解产物的奶香味浓郁、香气纯正、愉悦度较好。

表1 感官评分标准Table 1 The standard of sensory evaluation

2.2 响应面优化试验及结果分析

2.2.1 响应面优化试验的设计 本试验采用Design－Expert 7.0.0软件中的Box－Behnken Design（BBD）设计原理设计响应面试验，根据单因素试验的结果，乳化剂种类以及乳化剂使用量对于酶解反应的影响较小，综合多种因素选取底物浓度、pH、酶解温度、酶解时间4个因素作为变量，以感官评定分值为响应值设计了4因素3水平共29个试验点的响应面分析试验。试验设计的水平编码见表2，响应面分析方案和试验结果见表3。

表2 响应面分析因素及水平Table 2 Variables and levels in response surface design

2.2.2 二次多项式回归方程 采用Design－Expert 7.0.0软件，对表3中酶解产物的感官评分分值（Y）进行多元回归拟合统计分析，得到酶解温度（A）、酶解时间（B）、pH（C）、底物浓度（D）的二次多项式回归方程：

由表4可知，该模型F值为45.16，表明该模型高度显著；模型的P＜0.000 1，表明总体上模型各因素水平项极显著；失拟项不显著（P＝0.120 6＞0.05），模型的R2＝0.975 1，修正后为＝0.953 5，表明模型的相关度很好，可以解释酶解产物感官评分响应值的变化情况，综上说明该模型所得结果与实际状况拟合很好。

表3 响应面分析方案及试验结果Table 3 Arrangement and experimental results of response surface design

2.2.3 方差分析 该二次方程回归方差分析结果与回归方程系数显著性检验见表4。由表4可知，一次项A、C偏回归系数极显著，说明酶解温度和pH对酶解产物感官评分有极显著性影响；D偏回归系数高度显著，说明底物浓度对酶解产物感官评分有高度显著性影响；BC交互中影响高度显著，其余项间的交互作用不是很明显；二次项A2、B2、C2的偏回归系数达到极显著水平，D2的偏回归系数达到高度显著水平，所以由方差分析统计结果可知方程一次项、二次项对试验结果影响均很显著。综合以上各参数情况表明该试验方法有效可靠，可以通过该回归模型代替试验真实点对本试验结果进行统计分析。

表4 方差分析†Table 4 Analysis of variance

2.2.4 响应面分析 4个因素两两交互作用对酶解产物感官评分的响应面分析结果见图1～4。

（1）酶解产物感官评分随酶解温度和酶解时间的变化：由图1可知，在酶解体系pH为8.00，底物浓度为40.0%的情况下，随着酶解时间的延长，酶解产物的奶香味先增强后减弱；而随着酶解温度的增大，酶解产物的奶香味也是先增强后减弱，且其增幅较酶解时间的增幅大，说明酶解温度对酶解产物感官评分的影响较酶解时间对酶解产物感官评分的影响显著。

（2）酶解产物感官评分随酶解温度和pH值的变化：由图2可知，在酶解时间为3.50h，底物浓度为40.0%的情况下，随着酶解温度的增大，酶解产物的奶香味先增强后减弱；而随着pH值的增大，酶解产物的奶香味也是先增强后减弱，且其增幅较酶解温度的增幅大，说明pH对酶解产物感官评分的影响较酶解温度对酶解产物感官评分的影响显著。

（3）酶解产物感官评分随酶解时间和底物浓度的变化：由图3可知，在酶解温度为60.0℃，酶解体系pH为8.00的情况下，随着酶解时间的增大，酶解产物的奶香味先增强后减弱；而随着底物浓度的增大，酶解产物的奶香味也是先增强后减弱，且其增幅较酶解时间的增幅大，说明，底物浓度对酶解产物感官评分的影响较酶解时间对酶解产物感官评分的影响显著。

图1 酶解温度和酶解时间对酶解产物感官评分影响的响应面和等高线图Figure 1 Response surface and contour plots showing pairwise interactive effect of enzymolysis temperature and enzymolysis time on sensory score of enzymatic product

图2 酶解温度和pH对酶解产物感官评分影响的响应面和等高线图Figure 2 Response surface and contour plots showing pairwise interactive effect of enzymolysis temperature and pH on sensory score of enzymatic product

图3 酶解时间和底物浓度对酶解产物感官评分影响的响应面和等高线图Figure 3 Response surface and contour plots showing pairwise interactive effect of enzymolysis time and substrate concentration on sensory score of enzymatic product

图4 酶解温度和底物浓度对酶解产物感官评分影响的响应面和等高线图Figure 4 Response surface and contour plots showing pairwise interactive effect of enzymolysis temperature and substrate concentration on sensory score of enzymatic product

（4）酶解产物感官评分随酶解温度和底物浓度的变化：由图4可知，在酶解时间为3.50h，酶解体系pH为8.00的情况下，随着酶解温度的增大，酶解产物的奶香味先增强后减弱；而随着底物浓度的增大，酶解产物的奶香味也是先增强后减弱，且其增幅较酶解温度的增幅小，说明酶解温度对酶解产物感官评分的影响较底物浓度对酶解产物感官评分的影响显著。

综上所述，酶解体系pH与酶解温度的变化相对酶解产物感官评分的影响最显著，且影响的主次顺序为pH＞酶解温度＞底物浓度＞酶解时间。根据 Design－Expert 7.0.0软件对本试验酶解产物的感官评分结果进行最优化统计分析，最终确定本试验的最佳酶解条件为酶解温度61.0℃，酶解时间3.60h，pH 7.92，底物浓度36.0%，在此条件下预测到试验中酶解产物的感官评分为9.10。根据模型预测结果进行近似验证实验，并对酶解产物进行感官评定，验证实验得到酶解产物的感官评分为9.50，且酶解产物奶香味浓郁、香气纯正、愉悦度好，与预测试验结果一致。

3 结论

试验首先通过单因素试验研究了酶添加量、乳化剂种类、乳化剂使用量、底物浓度、pH、酶解温度和酶解时间对酶解反应产物奶香味的影响。并进一步结合响应面优化试验，得到影响酶解产物感官评分的4个主要影响因素的主次顺序为pH＞酶解温度＞底物浓度＞酶解时间。根据Design－Expert 7.0.0软件对本试验中酶解产物的感官评分结果进行最优化统计分析，确定最佳的酶解条件为酶解温度61.0℃、酶解时间3.60h、反应体系的pH 7.92、底物浓度36.0%，此条件下得到的酶解产物奶香味浓郁、奶香纯正、愉悦度好。

1 王蓓.酶法制备天然牛奶风味基料及牛奶香精的研究［D］.无锡：江南大学，2009.

2 汪薇，白卫东，赵文红.生物法制备奶味香精的研究进展［J］.中国调味品，2009，34（4）：27～30.

3 Hasegawa T.，Co.Ltd.Butter flavoring material containing lipase treated oils and fats：Japan，58043755［P］.1983－03－14.

4 Verhaeghe D，Ferijn H，Huyghehaert A，et al.Controlled lipolysis of milk fat with Rhizopus arrhizus lipase［J］.Milch Wissenschaft，1990，45（5）：273～280.

5 武彦文，欧阳杰，张津凤，等.酶法水解奶油制备奶味香精的研究［J］.中国调味品，2003（12）：39～42.

6 穆海波，黄汉荣，罗昌荣，等.一种以酶水解奶油为原料氧化热裂解为增香型奶香料的方法：中国，200710043986.0［P］.2008－01－09.

7 Jones L V，Peryam D R，Thurstone L L.Development of a scale for measuring soldier’s food preferences［J］.Food Research，1946（20）：512～520.