洋铁酸模中蒽醌类物质的提取技术分析

刘治林

【摘 要】目的探索高效、简捷的蒽醌成分提取方法。方法甲醇-超声法提取洋铁酸模中的蒽醌类物质，超声加热后再重新冷却处理；HPLC-MS检测提取物，并与乙醇提取法进行比较。结果甲醇-超声抽提法更有利于提取洋铁酸模中的蒽醌类物质，其提取效率是乙醇抽提法的6倍。结论甲醇-超声抽提法可以高效提取洋铁酸模蒽醌成分。

【关键词】蒽醌；洋铁酸模；提取

洋铁酸模Rumex patientia L，蓼科酸模属植物，其主要活性成分为蒽醌类物质，包括大黄素，大黄酚，大黄素甲醚及其苷类衍生物。

洋铁酸模中蒽醌类物质的提取通常采用乙醇作为抽提溶剂，但是不能获得较纯的蒽醌类物质，乙醇提取物形成浸膏不易萃取、分馏等操作，给蒽醌类成分的纯化带来困难。文献报道采用甲醇为抽提溶剂提取尼泊尔酸模（Rumex.C）中蒽醌类物质，杂质较少，且苷类成分提取率较高。本文采用甲醇抽提洋铁酸模中蒽醌类物质，并用HPLC-MS检测蒽醌类含量。由于蒽醌苷类物质衍生物比较多，HPLC-MS法没有用来可以跟踪检测的离子对，故本研究用酸将提取物完全水解成游离蒽醌，通过测定水解前后游离蒽醌的含量差值计算出蒽醌苷类的含量，并与乙醇抽提法比较，旨在寻找一种高效、简捷的蒽醌成分提取方法。

1.仪器与材料

洋铁酸模，当年9月份采自长春。大黄素、大黄素甲醚、大黄酚标准品，由长春药检所提供。其他试剂均为国产化学纯。

250DE超声仪（上海昆山超声仪器公司），RE52旋转蒸发仪（上海沪西分析仪器厂），C18柱46mm×150mm（美国AB公司），api4000高效液相四级杆串联质谱仪（美国AB 公司）。

2.方法

（1）甲醇-超声抽提法取400g洋铁酸模干粉以 4∶1的质量比加入甲醇溶剂，60℃超声30min，重复3次。将甲醇抽提液60℃减压蒸干。少甲醇溶解提取物，抽提液再次减压蒸干。80℃恒重2h，收集干粉为12g。

（2）乙醇抽提法用80%的乙醇提取20kg洋铁酸模根干粉，质量体积比为5∶1过夜，重复3次。将乙醇抽提液60℃减压蒸干。80℃恒重2h，收集浸膏状物质为120g。

（3）蒽醌苷水解产物制备。

甲醇-超声提取物与乙醇提取物各3.00g，加入50ml的2mol/L的HCl，加热冷凝回流2h。收集水解产物，60℃干燥。

（4）3种蒽醌类物质的标准曲线的制作大黄素8.6mg、大黄酚7.7mg、大黄素甲醚9.2mg，选用1∶1的甲醇氯仿定溶到10ml，再逐级稀释到3，1，500，200，100μg·ml-1。其中大黄素浓度选用0.3，0.2，50，20，10μg·ml-1。峰面积对浓度作图，得标准曲线。

（5）色谱和质谱条件的选择。

色谱条件甲醇∶乙酸铵∶甲酸=90∶10∶0.1，流速0.8ml·min-1。

质谱条件大黄酚：（Q1/Q2）252.8/224.9，分解能DP-60V，碰撞能CE-27V；大黄素：（Q1/Q2）269.0/225.1，分解能DP-25V，碰撞能CE-28V；大黄素甲醚：（Q1/Q2）283.0/240.0，分解能DP-50V，碰撞能CE-30V。不同浓度的溶液进色谱进行液质联用分析，上柱时间10min。

3种组份同时进样，有较好的跨度，分离条件合理。同浓度下大黄素甲醚的响应值偏小，大黄素的检测限是其他两种的10倍左右。

3.结果与讨论

（1）蒽醌标准品的工作曲线制作及浓度检测将峰面积Y对浓度X作图，经过spss11.0处理，得3条工作曲线的方程。

大黄素：Y（峰面积），X（浓度）（m/z283.0/240.1）：Y=2159.98X+20668.25（r=0.9996）；大黄酚：Y（峰面积），X（浓度）（m/z252.8/224.9）：Y=43X+-2.03e+003（r=0.9965）；大黄素甲醚：Y（峰面积），X（浓度）（m/z283.0/240.1）：Y=20.5X+-921（r=0.9981）。其中大黄素浓度在0.3～10ng/ml之间时具有较好的线性关系；大黄酚和大黄素甲醚在3～100ng/ml时有良好的线性关系。3条标准曲线R>0.99值均接近1，可以用来作为工作曲线。两种方法提取3种游离蒽醌的抽提率比较。两种抽提方法分别为甲醇超声法（methanol-ultrasonic）和乙醇提取法（ethanol exraction）。苷类通常在经过1h酸水解后，会完全转化为苷元。而本试验选用2h酸水解，以确保其完全水解。水解后蒽醌浓度减去水解前的蒽醌浓度得到的蒽醌苷类的提取率。两种方法提取3种游离蒽醌的抽提率比较。

（2）游离蒽醌和蒽醌苷类提取方法的比较，两种方法游离蒽醌提取率的柱状分析图，纵坐标为提取率，横坐标为提取方法。3种游离蒽醌在甲醇超声提取法中的提取率都高于乙醇提取法，总提取率是后者4倍。在甲醇超声提取法中大黄素是大黄酚和大黄素甲醚的3倍，说明洋铁酸模的游离蒽醌主要以大黄素的方式存在。

蒽醌苷类提取率的柱状图比较，纵坐标为提取率，横坐标为提取方法。可见甲醇-超声提取法在3种蒽醌苷类组分的提取率高于乙醇提取法6倍。

甲醇-超声提取法的蒽醌苷类含量也高于乙醇提取法，其中大黄酚的含量高于大黄素和大黄素甲醚。这说明在蒽醌苷类物质中，大黄酚苷是主要的存在方式。在游离形态下，蒽醌类物质更多的以大黄素存在；在结合形态下，蒽醌类物质以大黄酚的形态存在。以上两点可以说明，在洋铁酸模根中，大黄素溶解度较好，具有两个羟基，可以更稳定的存在，而最终的产物是大黄酚苷。大黄素甲醚无论何种情况下含量都很少，说明大黄素甲醚是一种次级代谢产物的中间体。以上结果还表明，蒽醌苷类的含量要远远高于游离蒽醌的含量，证明洋铁酸模中蒽醌类物质主要以苷类的方式存在。

（3）HPLC-MS法在蒽醌类物质提取时的可靠性和适用性液质联用法对于游离蒽醌的跟踪检测比普通高效液相法具有优势。蒽醌类和蒽醌苷类因为具有相同的生色团而有近似的紫外吸收光谱，因而单高效液相法会产生较大的误差。蒽醌苷衍生物较多，糖链连接方式和长度都难以确定，因此将蒽醌苷类水解成相应的游离物再进行液质法跟踪检测能准确得到蒽醌苷类的物质含量。

此外，通过液质联用方法检测蒽醌类物质的含量可以更加简化研究的方法，精确度更高，检测限更低，能够达到10-9g，传统高效液相检测法的不足是物质衍生物容易出现紫外干扰，蒽醌类物质的紫外吸收峰多在一起，且保留时间由于化学结构的接近而分离较窄。通过液质联用法可以对专一的离子对进行分析，不受紫外吸收杂峰的干扰，这是单一的高效液相系统不能达到的。

本研究选用甲醇超声法，得到的产物为干粉状物质，对照乙醇抽提法的到的浸膏状物质有利于进一步的分级提取。并且甲醇-超声抽法提取率高，能够充分利用羊蹄植物资源，为今后的羊蹄类植物开发奠定了基础。

【参考文献】

[1]张逢春，刘成柏，吴宗泽，齐晓娟，陈霞.甲醇-超声法提取洋铁酸模有效成分的研究.论文网，2011，04.